酶制剂的生产及其应用

第十三讲

酶制剂的生产及其应用1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物，从而开创了人类有目的地生产和应用酶制剂的先例。1911年，美国科学家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。此后，酶制剂的生产和应用就逐步发展起1949年，科学家成功地用液体深层发酵法生产出了细菌α－淀粉酶，从此揭开了近代酶工业的序幕。1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。20世纪70年代后期，酶工程领域又出现了固定化细胞技术。1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功，为酶工程的进一步发展开辟了新的途径。近20年来，随着基因工程的渗入，使酶的定向改造成为可能，所以在固定化酶、固定化细胞和固定化原生质体发展的同时，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景。

酶制剂生产的历史酶制剂的产品市场全世界已发现的酶有3000多种目前工业上生产的酶有60多种真正达到工业规模的只有20多种剂型和品种有60多个2001年为16亿美元每年约为7――8％的增长率发展预计到2008年销售额将达到30亿美元

酶制剂的产品结构80％的工业酶是水解酶，主要用于降解自然界中的高聚物，如淀粉、蛋白质、脂肪等物质。蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是目前工业应用的3大主要酶制剂。蛋白酶可用于去污剂、奶制品业、皮革业等；淀粉酶用于烘焙、酿造、淀粉糖化和纺织业；脂肪酶用于去污剂、食品和精细化工工业等。生产厂家世界上酶生产厂商有70多家，其中较大的有25家。最大的8家酶制剂生产厂商是：（1）

Novozymes（诺维信公司，丹麦）（2）

GistBroccdes（荷兰）（3）

Cultot（科特公司，芬兰）（4）

GenencorInternational（杰能科公司，美国）（5）

Solvay（苏尔威公司，比利时）（6）

ClrHansen（汉森公司，丹麦）（7）

RhonePonlene（罗兰，普朗克公司，法国）（8）

Quest（荷兰）酶制剂的用途UseofindustrialenzymesEnzymicprocesseshavealongtraditioninhumanhistory.Inancienttimesbrewingofbeerandmakingofwineareexamples.Inmorerecentyears,enzymecatalysishasplayedimportantrolesinproductionoffinechemicalsanddrugssuchasVc,aminoacids,antibioticsandsteroids.

Thebestknownexamplestothepublicareuseofenzymesindetergents.Atpresentadetergentalsocontainslipasesandamylasestodissolvefatandstarchstains.Inordertorestorecolourofcottonthathasbeenwashedseveraltimes,cellulasesareadded.Cellulasesarealsousedtogivejeanstheso-called“stone-wash”look.Enzymesarealsoextensivelyusedinotherindustriessuchaspulpandpaperindustry,textileindustry,leatherindustryandforbaking.Enzymesarealsousedindairyindustryandfortheproductionofwine,fruitjuice,beerandalcohol.Inparticularduetoneedofenantiopurepharmaceuticalsandbuildingblocksfororganicsynthesis,theuseofenzymecatalysisinfinechemicalsandpharmaceuticalindustryisincreasing.Whyareenzymesofinterestascatalystsinsynthesis?

Thereareuniqueadvantagesthatenzymesofferwhicharedifficulttoobtainbyconventionalcatalysis.Firstofall,theyhavegreatselectivityandspecificity.Nomatterhowsimpletheenzyme-catalysedchemicalreactionis,thismaybeonthreelevel:

chemoselectivity,regioselectivity

andstereoselectivity

and

stereospecificity.Chemoselectivity

istheabilityoftheenzymetodirectthecatalyticactiontoaspecificfunctionalgroupinthemoleculesoastodistinguishbetweenOHorNH.Whenthesubstratecontainsseveralfunctionalgroupsofthesamekind,asseenincarbohydrates,theenzymeisabletocatalysearegioselectivereactionofoneparticularOH-group.

Thestereochemcialpropertiesofenzymesareextremelyattractiveinorganicsynthesis.Enzymecatalysismaybeusedforproductionofenantiopurechiralmoleculeseitherbyenantioselectiveasymmetricsynthesisortoresolveracemicmixtures.Thestereochemicalpropertiesofenzymesareimportantbutsoisthefactthatenzymesworkundermildconditions.Thelatterisbecomingmoreandmoreimportantasgreaterdemandsaremadeonchemicalprocessindustryconcerningenvironmentalaspects.ImportanceofenantiopurecompoundsNomatterifapairofenantiomershaveexactlythesamechemicalandphysicalproperties,suchasmeltingpoint,boilingpointandspectraandevenshowthesamereactivityinandachiralenvironment,theyare,inprinciple,totallydifferentcompoundswhentheyinteractwithchiralmolecules.Itiswellknownthatsomeenantiomersmayhavedifferentodoursandtastes.Forexample,(S)-carvonetastesofcarawaywhilethethe(R)-enantiomertastesofspearmint.Theeffectofdifferentenantiomersmaybeparticularlysignificantfordrugs.Hencedrugsthatarechiralmustbeadministeredassingleenantiomers.Biotransformation

dealswiththeuseofbiologicalcatalyststoconvertasubstrateintoaproductinalimitednumberofenzymaticsteps.Biologicalcatalystswhencomparedwithchemicalcatalystshavetheadvantagesoftheirregioselectivityandstereospecificitywhichleadtosingleenantiomericproductswithregulatoryrequisitesforpharmaceutical,foodandagriculturaluse.Theyarealsoenergyeffectivecatalystsworkingatmoderatetemperatures,pressuresandpHvalues.Biotransformationshavebeenperformedbyavarietyofbiologicalcatalysts,suchasisolatedenzymes,cells,immobilizedenzymesandcellsthedevelopmentsofrecombinantDNAtechnologyhaveledtoimprovementsintheenzymeproductionindifferenthostorganismsgivingthebioprocessengineeragreaterchoiceofbiocatalystoption.诱导酶与组成型酶需要加入诱导物才可以产生的酶叫诱导酶不需加入诱导物就可以产生的酶叫组成型酶不需加入诱导物就可以产生诱导酶的突变株，叫做组成型突变株（调节性突变）酶的生产酶的生产技术培养基pH温度DO培养基碳源氮源碳氮比无机盐生长因子产酶促进剂碳源许多酶类生产以玉米粉、甘薯粉、淀粉等为碳源，价格便宜，而且对产酶有诱导作用有些碳源对酶的合成有分解代谢产物阻遏作用，要注意控制其浓度氮源氮源对微生物产酶有诱导和抑制作用多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用，在高浓度的有机氮源外添加1-3%的无机氮源碳氮比碳氮比低有利于菌体生长的需要，种子与发酵前期采用低碳氮比碳氮比高有利于菌体产酶的需要，发酵中后期采用高碳氮比无机盐同其它微生物产品生产一样

氨基酸、维生素、嘌呤碱和嘧啶碱，通过加入玉米浆、酵母膏、麸皮、米糠以及豆饼和玉米来提供生长因子产酶促进剂诱导物或诱导物前体表面活性剂，胞外酶，一般使用非离子表面活性剂，而不用阳离子或阴离子试剂pH黑曲霉生产糖化酶同时产生-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶pH倾向中性时，糖化酶活性低，另两种酶活性高pH倾向酸性时，糖化酶活性高，另两种酶活性低温度控制

根据菌体生长和酶合成的需要，进行变温生产，以枯草杆菌As1.398进行中性蛋白酶生产，培养温度必须从31ºC逐渐升温至40ºC，然后再降温至31ºC，蛋白酶产量比不升温者高66％DO一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利；通气量大则相反但也有相反的情况，如黑曲霉的-淀粉酶的生产，酶生产时菌的需氧量为生长旺盛时的36-40%α-淀粉酶生产工艺

生产菌种：芽孢杆菌，BF-7658

生产工艺流程斜面孢子悬浮液种子罐

发酵罐提取斜面

马铃薯培养基或淀粉蛋白胨培养基茄子瓶50ml左右，37℃72h

孢子悬浮液

用50ml无菌生理盐水洗下种子及发酵培养工艺配方

种子罐3M3发酵罐30M3总配比基料补料豆饼粉45.65.35.5玉米粉3117.222.3Na2HPO4

0.80.80.80.8(NH4)2SO4

0.40.40.40.4NH4Cl0.150.150.130.2淀粉酶

10-15万单位

100万单位

30万单位

CaCl2

-0.20.130.4体积

12m3

4m3

不同阶段通风比为：种子罐0-10小时，1:1.3；10-14小时1:1.45发酵罐0-12小时，1:0.74；12小时以后1:1.46-1.1中间补料:12小时后，每隔1小时补料一次直至多40小时左右。pH高于6.5，菌体空泡多，意味着出现衰老，多补一些。补料结束后6-8小时，升至7.5，营养细胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。

补料优点：（低浓度发酵和高浓度补料）1、有利于菌体生长产酶2、发酵后残糖、残氮低，便于提取3、高浓度补料可以保持环境稳定，延长产酶期，增强菌体产酶的诱导作用，增加产酶量ProductionofaminoacidsbybiotransformationsProductionofL-phenylalanine苯丙酮酸＋天冬氨酸苯丙氨酸天冬氨酸转氨酶酶转化过程天冬氨酸转