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文档简介

实验八产淀粉酶菌种的鉴定实验目的1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规实验技术与方法；2.熟悉16SrRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCR的操作技术；3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定分析。实验原理

细菌分类鉴定的方法：形态学特征的鉴定生理生化特征的鉴定分子特征的鉴定形态学的鉴定固体平板菌落，固体斜面，半固体穿刺，液体的培养特征；显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位置）等。

分子鉴定16SrDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基16SrRNA的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定，确定细菌在进化中的位置。16SrDNA序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物，并且扩增出所有细菌的16SrDNA片段。可变区因细菌而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。扩增细菌的16SrDNA基因需要其染色体DNA作为模板进行PCR，可以提取细菌染色体DNA作为模板，也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做PCR以达到快速简便的目的。PCR的原理和步骤原理

PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。步骤变性（Denature）：目的双链DNA片段在95℃下解链；退火（Anneal）：两种引物在适当温度（59℃左右）下与模板上的互补序列通过氢键配对；延伸（Extension）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些合成的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。5’5’3’3’PCRCycle1Denaturation95℃

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