荧光原位杂交技术在环境微生物分析中的应用

荧光原位杂交技术在环境微生物分析中的应用

随着世界经济的快速发展和水量的急剧增加，污水处理厂在控制水污染和水环境方面发挥着越来越重要的作用。目前我国有80%的污水处理厂采用活性污泥法处理污水。活性污泥法降解能力强,处理程度高,但活性污泥的稳定性难题一直有待解决。活性污泥中微生物菌群的组成、结构与功能决定了活性污泥和生物膜的生物活性,继而从根本上决定了废水生物处理系统的污水处理能力。我国绝大部分污水处理厂存在不同程度的污泥膨胀现象,活性污泥系统的不稳定性影响出水水质、增大污泥的处理费用,并且极易引起大量污泥流失,严重时可导致整个处理工艺难以短时间恢复。因此,研究活性污泥及生物膜微生物菌群的组成、结构与功能,对于提高废水的生物处理效率具有重要意义。传统的微生物菌群结构分析方法包括显微镜观察和分离培养、依据形态结构特征和生理生化特征进行分类鉴定等。这些方法能从活性污泥中分离和鉴定大量细菌,并对微生物的多样性和动力学进行分析,但此类方法非常耗时,不足以反映微生物在环境中的真实情况,存在很大的局限性。近年来,针对传统的微生物分析方法存在的问题,废水处理领域的一些研究者开始尝试将荧光原位杂交技术(fluorescentinsituhybridazation,FISH)用于引起污泥膨胀的丝状菌菌群、脱氮细菌菌群、除磷菌菌群、产甲烷菌菌群等的分析,并取得了初步的成功。FISH作为微生物数量和特性考察的手段,具有种属特异性,即只与目标细菌的16SrRNA或23SrRNA结合,通过结合的探针可以鉴定微生物的种类。与其他可以将微生物量化的方法(如定量聚合酶链式反应即PCR)相比,FISH技术可以同时考察微生物群落的结构和数量信息。研究表明,FISH技术对特定微生物种群定性和定量时,获得结果快,可自动读取、保存和回顾载物片信息,灵敏度高、选择性好、取样易且少,并能提供较多的物理参数。1fish技术的发展和技术原则1.1荧光探针检测微生物1969年,Pardue和Gall两个研究小组发明了原位杂交技术(insituhybridization),将放射性标记的DNA或28sRNA杂交到细胞制备物上,通过放射自显影技术(microautoradiography,MAR)检测杂交位点,该技术可在不破坏细胞完整形态的情况下在细胞内检测核酸序列。1988年,Giovannoni等首次将FISH应用到细菌学的研究中,使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展,放射性材料被非同位素染料代替。1989年,DeLong等首次将荧光标记寡核苷酸探针用于检测独立的微生物细胞。与放射性探针相比,荧光探针具有分辨力强、安全性高、检测步骤少的优点。在伸展性DNA纤维(extendedDNAfiber)上进行FISH,已将分辨率提高到与常规分子生物学技术SouthernBlot分析相当的水平。近几年,由于FISH技术的灵敏性和快捷性,该技术已成为微生物系统发育学、微生物生态学、微生物诊断学和环境微生物学研究的有力工具。1.2原位检测方法FISH是将细胞原位杂交技术和荧光技术有机结合而成的新技术。将待测微生物基因组核酸分子变性后,利用荧光标记的特异寡核苷酸片断作为探针,依据碱基互补原理,与变性后的DNA或RNA分子进行原位杂交,在一定激发波长下用荧光倒置显微镜、放射自显影、流式细胞仪或激光扫描共聚焦显微镜等手段对杂交信号进行检测和扫描,并用相关统计软件分析其与活性污泥类型和运转效能间的关系,或建立数学模型用于预测活性污泥的运转状况。16SrRNA基因存在于所有细菌的染色体中,具有系统发育上的相对保守性,且分布广泛、功能稳定,同时核苷酸数目适中,所以FISH技术通常将16SrRNA作为探针结合对象。16SrRNA的保守性是相对的,不同细菌的16SrRNA序列有着不同程度的差异,针对目标微生物体内某段有差异的序列设计出相应的寡核苷酸探针,就可以实现对目标微生物的原位检测。图1和图2为FISH过程的原理图。1.3fish技术测量荧光染料荧光标记探针的检测方法FISH所采用的探针必须具有特异性强,灵敏度高,良好的组织渗透性。一个典型的寡核苷酸探针长度一般是15~30bp。FISH技术的常用探针可分为3类:第1类是包括α卫星和卫星Ш类的染色体特异重复序列探针;第2类是全染色体或染色体区域特异性探针,由一条染色体或其上某一区域几段不同的核酸片段组成;第3类是位点特异性探针,这类探针由1个或几个克隆序列组成。FISH技术所用探针的标记方法有直接标记法和间接标记法。间接标记法是指将标记物(如地高辛、生物素)连接到探针上,再利用偶联有荧光染料的亲和素或抗体进行检测的方法。直接标记法是用荧光染料直接标记核苷酸,该方法的探针标记种数不受限制,比间接标记操作简单,但不如间接标记探针灵敏,不过靶序列片段较大时(数百kb),测量结果仍较可靠。表1列出了常用的寡核苷酸探针。2fish技术的定量和定性方法FISH定量、定性方法包括荧光显微镜下的人工计数、计算机图片处理算法和光密度测定法,本文简要介绍前两种方法。2.1算术平均细菌浓度计算荧光显微镜下人工计数过程如图3所示,对每个样品制作2个载玻片,然后在荧光显微镜下对处理好的载玻片中的每个视野进行观察、计数,图中A表示算术平均处理后的细菌数,A1、A2分别为2个载玻片的算术平均细菌数,而细菌浓度与A成正比,同时与试样面积S(mm2)和视野面积SA(mm2)之比呈正比,N为试样量(μmL),通过公式:细菌浓度=1000/N×A×S/SA(细菌数/mL)可求出具体细菌浓度。荧光显微镜下计数的方法有其固有的缺点,耗时长,能杂交的细胞数量有限,并且需高放大倍数的共焦激光扫描显微镜(CLSM)观测。2.2建立前处理算法荧光显微镜设备一般本身自带图像分析软件,计算机图片处理算法首先对固定好的杂交样品进行数字图像分析,根据不同浓度时被检测物质在总标记物中的面积比绘制对数曲线图,然后根据回归方程将测验结果折算成真实浓度。3fish技术的实验步骤3.1玻璃处理为使样品和玻片更好地结合,首先用覆膜剂处理。常用的覆膜剂有明胶、聚-L-赖氨酸等。3.2低聚甲醛、戊二醛和戊二醛的表征常用的固定液有甲醛水溶液-乙酸(Formalin-AceticAcid,FAA)、低聚甲醛(Paraformaldehyde)和戊二醛(Glutaraldehyde)。3.3样品预处理采用梯度脱水法对样品进行脱水处理,用表2中的8个梯度从上至下依次脱水,自然干燥。3.4数据处理先进行HCl处理和蛋白酶K消化;然后进行固定和脱水,依次用40mg/mL低聚甲醛/磷酸盐缓冲液(PBS)、1×PBS和1mL/L乙酸酐与0.1mol/L三乙醇胺(TEA)配成的溶液,先后对样品进行固定处理,再用H2O、15%、30%、50%、70%、85%、95%和100%乙醇梯度脱水,自然干燥。然后进行杂交,将探针加到杂交液中,预热至45℃,提前打开42℃培养箱,预热湿盒。每个玻片小槽涂40μL,盖上盖片后用石蜡烃薄膜(parafilm)封紧边缘。将载片放于湿盒于42℃过夜,然后放入37℃2×SSC的冰盒中,漂去盖片,再洗脱。3.5ase储液的制备先后于37℃下在染色缸中用2×SSC和1×SSC洗2×15min,然后进行核糖核酸酶(RNase)处理,把40μL20mg/mLRNase储液加入到40mLNTE中(终浓度20μg/mL),放入载片,37℃温育30min。37℃下0.5×SSC洗2×15min。放入PBS中,4℃过夜或直接进行检测。由于氢键具有微弱性,互补的单链核苷酸分子经退火而形成核酸双链分子的过程是可逆的,改变反应的物理和化学条件可影响核酸双链分子生成的速度、转化率及其稳定性。影响2段互补核苷酸链杂交的主要因素包括温度、pH、溶液中单价离子的浓度、甲酰胺浓度。4在微生物生态学检测方面的应用进展FISH能再现为环境中完整细胞的影像信息,具有较好的精确性,已在细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用。近几年来,FISH在水污染控制微生物生态学中的应用也得到了一定发展。常规的方法是通过检测特异底物转化率来研究活性污泥中重要功能菌群的活性,如氧消耗率、硝化、反硝化、磷吸收和释放、Fe3+的还原等。放射自显影和FISH(MAR-FISH)可结合用于研究水体微生物,能同时获得复杂环境中特定微生物的种属和功能特性,检测细菌活性、数目和对特异有机底物的消耗特点。此外,FISH技术还常和PCR、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)等技术结合使用。4.1处理工艺与对象技术的应用目前主要是根据颗粒污泥切片的扫描电镜照片来推测厌氧颗粒污泥的结构,但是细菌本身的多态性决定了这种方法存在明显不足,而利用FISH技术可以在一定程度上真实反映出颗粒污泥内部微生物的组成和空间分布情况。Flaherty等将共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)与FISH结合使用,对厌氧反应器中颗粒污泥的污泥菌群组成、分布和定量识别等方面进行研究,这种结合技术表现出了巨大的应用潜力。Sanctis等利用FISH技术跟踪研究序批式生物滤池(SBBGR)中污泥从接种到挂膜和形成颗粒污泥的过程中污泥菌群结构的变化,研究表明,颗粒污泥在形成过程中菌群组成发生明显变化,当以变形菌为主要的活性菌群稳定出现时,颗粒污泥处理污水的效果最好。孙寓姣等利用细菌探针EUB338-cy3和古菌探针ARC915-fitc对3个厌氧产甲烷颗粒污泥样品的超薄切片进行了FISH分析,得到了颗粒污泥样品中细菌的分布情况。Weber等将FISH技术与扫描电镜、光学显微镜和共聚焦显微镜结合起来,分析研究了从生物膜的形成到好氧颗粒污泥的形成过程中污泥的结构,并对FISH法进行了改良。4.2膜生物反应器中硝化细菌菌群的变化传统研究硝化细菌的方法是将硝化细菌从环境中富集、分离,然后在形态学上加以分类、鉴定。FISH技术利用硝化细菌特异性的靶寡核苷酸探针,在原位检测水环境或生物膜上的硝化细菌时,能同时实现定性、定量分析,为研究硝化系统中硝化细菌类群的空间和数量分布提供了有效的检测手段。张丹等应用FISH技术对氧限制自养硝化反硝化(OLAND)生物脱氮系统中硝化阶段不同时期硝化菌群的变化进行检测,揭示了随溶氧浓度的降低,氨氧化菌的数量基本保持恒定、亚硝酸氧化菌的数量略有减少的变化规律,并且发现在两阶段OLAND生物脱氮系统中氨氮的氧化主要是由Nitrosomonassp.完成,亚硝酸的氧化主要由Nitrobactersp.完成。Pala等应用FISH技术对中试膜生物反应器中硝化细菌菌群进行定性定量分析,结果表明,样品中的硝化细菌中亚硝化细菌是优势菌种,在总菌群结构中的相对丰度为13%,膜生物反应器性能与硝化细菌的浓度呈正相关性。Rongsayamanont等利用FISH法分析了不同条件下的硝化菌和氨氧化菌组成和数量,FISH样本通过倒置的奥林巴斯显微镜观察,并利用CLSM成像、观测,经BA505-525和BA565IF两种滤光片分别收集OregonGreen488标记的探针和若丹明红标记的探针发出的荧光;软件DAIME作为一种图像分析软件,帮助比较目标光源(标记硝化菌和氨氧化菌所发荧光)在细菌总体光源中所占比例。图4和图5为显微镜成像示例,其中红色代表硝化细菌(探针Nso190标记),黄色表示硝化菌和总菌的混合物,绿色表示总菌(探针EUB338标记)。该试验表明,Nitrosomonoseuropaea是主要的AOB(氨氧化细菌),Nitrobacter属是主要的NOB(亚硝酸盐氧化细菌)。4.3微生物的聚磷效果近年来,随着对污水生物法除磷机理的深入研究和对污水处理装置的不断优化,迫切需要更加快速、准确和精细的分析手段来定性、定量处理系统中特定细菌并剖析其群落结构。在对聚磷菌(PAOs)的量化研究中,FISH这种技术被广泛应用。20世纪90年代初就有研究者应用FISH对PAOs进行研究,在不同规模的反应器和进水水质条件下,得到了不同优势种群的微生物,但是逐渐统一地认为β-Proteobacteria中的类似Rhodocyclus组菌起主要的聚磷作用。Kawaharasaki等采用DAPI荧光染料和α-,β-和γ-Proteobacteria特异性低聚核苷酸探针,对厌氧/好氧序批式生物强化除磷(EBPR)反应器中活性污泥聚磷酸盐积累菌(PAO)进行了识别。结果表明,所采用的FISH技术是现场识别PAO细菌的有效方法,可为稳定操作EBPR工序提供有用的监控信息。Burow等采获了10个不同污水处理厂的污水样本,用FISH法观察了EBPR污水处理系统中的聚磷菌和聚糖菌:以EUBMIX(以FLUOS染色)标记总菌,DF1MIX和DF2MIX(以Cy3染色)分别标记组1和组2中的Alphaproteobacteria,用共焦激光扫描显微术结合ImageJV1.35k对细菌Alphaproteobacteria在总菌中的面积比加以分析。结果表明,Defluviicoccus的存在量较小,不管是厌氧还是有氧情况下,组1和组2中的Defluviicoccus菌均有利用醋酸盐、葡萄糖、丙酮酸盐等物质的摄取习惯。Ahn等研究了好氧序列间歇式反应器中的微生物对低化学需氧量(COD)废水中磷的去除效果,采用FISH法对微生物进行定量、定性分析。以Cy5、Cy3、FLUOS3种染料对探针DECH454和DECH472染色,分别对2种水样中的Dechloromonas加以标记,结果表明2种水样中均存在大量该菌,利用MAR-FISH技术还检测到系统中起主要除磷作用的PAO为CandidatusAccumulibacterphosphatis。4.4抗菌体的分析Speirs等利用FISH技术对污水中的丝状菌进行检测,发现污泥膨胀中常出现的Eikelboomtype0092属Chloroflexi门,在全面强化除磷系统中,该丝状菌以2种不同的变异体出现,且在大部分情况下是同时存在的。如图6中的3张分析图,图a表示对水样进行Neisser染色时大部分的水样都有对该染色有反应的短径丝状体;利用FISH分析水样,EUB338I,II,和III均无法标记丝状菌,用探针GNSB941和CFX1223标记时,则可以检测到荧光信号,如图b;图c中的紫红色表示的是对探GNSB941/CFX1223mix(CY5)和CFX223(CY3)均有反应的绿弯菌门(Chloroflexi)0092。5用于原位杂交过程的新技术FISH技术的优势在于可以了解微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等,但其在应用过程中还存在着检测的假阳性、假阴性问题,诸如:微生物自身荧光的影响、探针缺乏特异性、穿透率不足、低rRNA含量和荧光褪色等。作为一项新兴的研究手段和工具,在今后的研究工作中还需要在以下几个方面进行加强和改进:(1)优化杂交过程中的各种操作条件,如:杂交和洗脱的温度、变性剂浓度及探针长度和浓度,这些杂交条件在很大程度上决定着探针的特异性和灵敏性;(2)开展探针标记技术的研究,提高探针灵敏度,完善荧光信号检测技术。探针与被检测物的结合强度是保证灵敏度的一个关键前提,合适的荧光团和探针对FISH检测效果有较大影响。量子点荧光标记探针与传统荧光探针相比,荧光强度高,化学稳定性好,抗光漂白性能强,可实现对细胞的多色标记。Mitchell等利用量子点表面的Zn原子与巯基之间的配位作用实现了对目标DNA分子的检测。Pathak等首先将羟基吸附在量子点表面,经过一系列的反应,最后将不同的寡聚核苷酸通过氨基甲酸酯偶合到羟基上。这种多色的量子点寡聚核苷酸探针可稳定存在几个月,并且解决了核酸探针在杂交过程中的非特异性键合问题,将其用于原位杂交过程,可进一步检测染色体的异常和突变;(3)新型探针的研究设计,如PNA(PeptideNucleicAcid,即核肽酸)探针。该探针稳定、不易降解,其主链骨架呈中性,通常比寡核苷酸探针短,表现出较好的渗透性。PNA探针技术在微生物检测领域具有极大的潜力。尽管目前对其研究仍然在初步阶段,但随着进一步的研究,它的广泛应用指日可待;(4)FISH技术主要应用在细胞组织内部,根据碱基配对原理,利用荧光探针与目标细胞中的同源16srRNA特异结合,从而达到研究细胞的目的。这种在不破坏细胞的情况下发生在组织内部杂交反应,存在许多不稳定的问题。如荧光发生褪色、低16srRNA含量、探针损伤,以及穿透率不足带来的杂交率低,都将影响到后来的细胞观察准确率。如果这种杂交发生在细胞膜表面,则可以解决很多由于穿透率不足、内部组织影响带来的褪色问题。探讨细胞的具体结构、细胞膜上对特异探针的结合点即靶点,可实现细胞膜上的直接杂交,减少FISH步骤和反应时间,从而能更好地对目标细胞进行观察和定量定性分析。通过研究特定菌种的代谢途径、特定结构特征或摄食专一性,找到与细胞膜有关的特定物质,可实现靶点标记。将这种技术应用在污水处理中,结合生物传感器等的使用,对优势菌等目标菌实现动态观测和分析,将是一个重大的突破。具体可能实现的标记途径有:1)特定菌种的代谢途径,活性污泥中的各类菌种在处理污水中扮演着不同的