荧光原位杂交技术在遗传育种中的应用

荧光原位杂交技术在遗传育种中的应用

荧光原杂交技术（fish）是近年来生物领域发展起来的一项新技术。它使用了细胞遗传和生物学的原理，并将通过荧光标记的核酸检测与细胞内的核酸序列混合。借助荧光显微镜,在细胞和(或)组织中观察并分析细胞内杂交于靶序列的多种彩色探针信号,以获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。这一技术已被广泛用于遗传疾病、肿瘤研究及临床诊断和治疗监测。现就FISH的发展历程、探针制备和临床应用做一概述。1原位杂交技术的应用1969年,Pardne和John分别公布原位杂交技术,仅使用放射性同位素标记核酸用于原位杂交。同时能用于标记的核酸也受到限制,只能纯化到一些微卫星DNA和核糖体RNA用于原位杂交。但随着分子克隆技术、同位素标记技术以及核酸的化学合成技术的进步,原位杂交技术被广泛应用于对细胞内mRNA拷贝数的检测。尽管当时原位杂交技术具有高度的特异性和灵敏度,但鉴于放射性同位素自身的特性,如安全性、空间分辨率低、不稳定性等问题,这项技术仅应用在实验室研究方面。1980年出现非放射性原位杂交技术后,该技术摒弃了放射性,但需要多步骤的免疫化学反应的检测和信号放大,方法繁琐,并存在敏感度低和高背景问题。1986年建立的FISH技术使用荧光标记与检测系统进行信号的检测,具有敏感度高、信号强、背景低、快速等优点。此后,该技术迅速发展,探针标记物越来越多,不仅从单一荧光发展到多色荧光检测,而且应用范围也进一步扩大,不仅可以用于分裂相细胞而且可以用于间期细胞检测,这为FISH技术的临床应用铺平了道路。2dna探针检测FISH探针是一段标记了荧光素或半抗原的RNA、DNA或肽核酸序列。但由于RNA的不稳定性和在环境中易降解,而肽核酸又由于合成困难等原因只能用于制备一些长度较短的探针,因此目前临床使用的探针都是以DNA为主。目前常用的探针主要有:(1)染色体特异的着丝粒探针。其包括卫星Ⅰ和卫星Ⅲ类探针等。杂交靶位常大于1Mbp,信号强,主要用于检测染色体的数目异常。(2)位点特异型探针。这类探针由一个或几个克隆序列组成,可由cDNA克隆或克隆到大片段插入载体的核酸片段制取。主要用以染色体DNA克隆序列的定位和靶DNA序列拷贝数及结构变化的检测。(3)染色体涂染探针。全染色体(涂抹)涂染探针(wholechromosomepaintingprobe,WCPs)是针对某一整条染色体设计探针,涂染探针主要用于常规显带技术无法确定的染色体重排和标记染色体的确定。利用涂染探针研究复杂染色体畸变可节省时间,结果容易判读。然而,整条染色体涂染探针不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。Guan等运用染色体切害技术制备了人类染色体24个长臂及19个短臂的染色体臂涂染探针(chromosomearmpaintingprobe,CAP),弥补丁WCPs探针的不足。制备探针过程中探针序列主要通过克隆(如质粒、粘粒、YAC克隆、BAC克隆)或通过酶法扩增(如PCR法)获得。探针标记方法主要有两类:一是直接标记法,就是荧光素通过一些方法直接连接到核酸序列上;二是间接标记法,就是把地高辛或生物素等半抗原连接到核酸序列上,然后在杂交过后的检测阶段,加入标记有荧光素的相应半抗原抗体参与反应进行检测。这两种标记方法相比较而言各有利弊。直接法方便、快捷且背景低,但信号强度不及间接法强;间接法具有信号放大系统,信号强检测灵敏度高,但是间接法杂交过后检测步骤繁琐,背景信号强。在临床应用上,鉴于直标法已经可以获得较满意的信号,而且操作步骤简单,故目前临床检测用的探针多为直接标记法标记。目前主要使用切口平移法、随机引物法和PCR法把荧光素或半抗原标记到探针上[10~13]。3临床应用3.1fish的检测结果目前,产前诊断的金标准还是依赖核型分析。核型分析的主要优点在于不仅可以检测染色体数目异常而且可以检测染色体的结构异常,检测准确率可达99.5%以上。缺点则主要是核型分析需要对胎儿细胞进行培养,时间需要12.5d左右,过长的等候时间给孕妇带来额外的精神负担,而且进行核型分析劳动强度大,结果判读困难。近来开发出一些快速产前诊断方法来满足临床的需要。FISH技术最先在美国用于产前诊断,早在1993年FISH技术就被美国遗传学会(ACMG)允许用于产前辅助诊断,最终的确诊还需要依赖核型分析。而到2000年鉴于FISH技术具有高度的敏感性和特异性,ACMG宣布FISH技术可以用于常见染色体数目异常的确诊,而不再仅仅作为辅助性产前诊断手段。在2001年,Tepperberg等对FISH技术进行快速产前诊断的结果与核型分析结果进行了大样本比较,共47312份有效标本中,FISH法仅有9例出现了假阳性结果,假阳性率为0.019%,有32例出现了假阴性结果,假阴性率为0.049%。FISH进行快速产前诊断具有非常高的灵敏度和特异度,可以用于常见的染色体数目异常的诊断。此后,FISH技术在一些发达国家被广泛用于快速产前诊断。由于13、18及2l号染色体以及X和Y染色体数目异常占胎儿染色体异常的65%,占胎儿染色体数目异常的80%~95%[17~19],因此目前FISH方法检测试剂盒主要是针对这5条染色体,检测结果一般可以在24~48h就可以获得,且检测结果与核型分析结果的一致性可以达到99.5%以上。结果直观且便于解释,满足了临床的需要,有利于临床决策和减轻孕妇过于焦虑的情形。3.2fish的应用于其他治疗患者的检测血液肿瘤是我国十大高发肿瘤之一,随着对疾病发病机制的深入研究,发现细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义。但常规的细胞遗传学分析方法只能分析中期染色体,而对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。而FISH技术弥补了传统细胞遗传学在这方面的不足,因此被广泛用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。在临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在以下几个方面:(1)染色体异位形成的融合基因检测。如慢性粒细胞白血病(CML)的BCR-ABL融合基因检测,急性粒细胞白血病(AML)M3中的PML-RARA融合基因检测和M2b中的AML1-ETO融合基因检测以及儿童B淋巴细胞性急性淋巴细胞白血病TEL-AML1融合基因检测等。对融合基因的检测不但有助于对疾病的诊断,还能帮助我们估计患者预后情况以及选择有效的治疗方案。如对M3患者检测是否伴有PML-RARA或PL2F-RARA融合基因,如有PML-RARA融合基因则用全反式维甲酸治疗预后好,而伴有PL2F-RARA融合基因则预后差且需要选择其它治疗方案。(2)基因缺失的检测。一些关键基因的缺失有助于我们对肿瘤进行诊断以及预后判断。但是目前的显带技术分辨率低,只有大于4.5Mb的缺失才能检测到,而FISH分辨率高,可以弥补显带技术用于检测微小缺失的不足。在临床中,如通过荧光原位杂交发现多发性骨髓瘤(MM)患者的P53基因缺失提示患者的预后很差,接受治疗后中位生存期仅为15.9个月。而在慢性淋巴细胞性白血病患者中,如检测到RB1的缺失则提示患者预后较好,中位生存期可达到133个月。(3)微小残留病灶的检测。由于白血病患者经化疗缓解后,体内仍残留一定数目的白血病细胞,这些残留的白血病细胞是导致复发的根源。通过对肿瘤细胞特异的染色体异常进行跟踪监测,可间接了解体内白血病细胞数量变化,便于了解病情进展和是否出现复发迹象。(4)对异性间造血干细胞移植的植入状态监测。异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation,allo-HSCT)已经成为治疗血液系统恶性、非恶性疾病的有效手段。移植后供体干细胞是否在受者体内植活以判断移植成功与否对指导移植后治疗和预测复发具有十分重要的意义。FISH技术具有操作简便、实验周期短及结果敏感可靠等优点,目前国外已较多应用于异性异基因造血干细胞移植后植入状态的检测。其主要通过性染色体计数探针动态监测供/受者混合性嵌合体比例变化判定移植是否成功。3.3组织标本:监管叶片是一种固定的组织标本FISH几乎可以快速检测任何类型组织细胞的染色体异常,不管组织是新鲜的或是一些甲醛溶液(福尔马林)固定的陈旧组织标本。因此,FISH被广泛接受用于乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的辅助诊断,其目的主要集中在对肿瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。3.3.1乳腺癌基因检测23.3.2内外发育中对her2基因的扩增和保护Cajulis等通过研究认为对膀胱脱落细胞进行FISH检测染色体异常有助于辅助诊断膀胱癌。2000年,就有文献报道使用商业化探针UroVysis(雅培公司)用于膀胱癌的诊断,灵敏度达到82.4%,特异度为91.8%,好于一般检测方法。FDA于2001年7月批准UroVysis用于临床监测膀胱癌复发。它通过荧光原位杂交检测尿脱落细胞3、7、17号染色体非整倍体和染色体9p21(p16基因)丢失用于确定细胞是否发生癌变,也可用于存档病理切片和存档尿脱落细胞学分析。其敏感度和特异度均较高,最近几年的研究表明:该探针用于诊断膀胱癌的灵敏度高于尿脱落细胞细胞学检测(75%∶42%),但特异度比尿脱落细胞学检测略低(85%∶93%)。FISH另一个重要特征是比膀胱镜更易早期发现膀胱癌。Halling等对11例膀胱镜检查阴性而FISH阳性患者进行了3~12个月随访,发现7例(64%)发展为膀胱癌;Michael等报道了36例膀胱镜检查阴性,而FISH阳性患者在随访的3~16个月(平均6个月)中,有15例(41%)确诊为膀胱癌,有68例膀胱镜检查阴性而FISH阴性,在随访的3~19个月(平均11.2个月)中,只有13例(19%)确诊为膀胱癌。在原发性乳腺癌中有20%~30%的人类表皮生长因子受体2(HER2)基因的扩增和蛋白过度表达。HER2过度表达的乳腺癌浸润性强,无病生存短,预后差。另外,HER2的状态是乳腺癌药物(蒽环类药物和曲妥珠单抗)治疗的主要参考指标。其中曲妥珠单抗(赫赛汀)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,选择性地作用于HER2的细胞外部分,适用于治疗HER2过度表达的乳腺癌。由于只有HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌患者用赫赛汀治疗才有效,因此检测HER2的状态非常重要。目前主要采用两种方法进行检测HER2状态:一是采用免疫组化法检测HER2受体蛋白的过度表达,二是应用FISH法检测HER2基因扩增的水平。由于一些回顾性研究发现用FISH法预测赫赛汀疗效好于免疫组化法[29~31],因此,FISH被认定为检测HER2状态的金标准。但是由于免疫组化法比FISH方法简单、价格便宜,因此目前临床上最常用免疫组化分析HER2的表达状态。但是很多临床机构研究发现,虽然免疫组化法检测为阴性或是强阳性的标本与HER2基因扩增状态具有很高的一致性,但免疫组化法检测为中度蛋白表达的标本其HER2基因并不一定处于扩增状态,因此,建议免疫组化法应作为筛查手段,对那些筛查为中度HER2蛋白表达的病例需要进一步进行FISH确诊[33~36]。膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤。在国外,膀胱肿瘤的发病率在男性泌尿生殖器肿瘤中仅次于前列腺癌,居第2位;在国内则占首位。膀胱癌在50~79岁年龄段发病率最高,约占80%。在膀胱癌中移行细胞癌最常见占95%,具有多病灶和高复发率,超过70%浅表膀胱癌初次治疗后会复发,约15%发展为浸润性癌,因此,膀胱癌患者术后监测尤为重要。膀胱镜检查和尿脱落细胞分析为目前常用于发现和监测膀胱癌复发的方法,但膀胱镜检查系有创性检查,尿脱落细胞分析敏感度太低,膀胱癌抗原(BTA)、端粒酶分析、血红蛋白检测片、核基质蛋白(NMP22)等