牙周炎动物模型研究进展

牙周炎动物模型研究进展

牙龈炎是一种发育在牙齿支持组织的炎症损伤性疾病。本研究中的牙周炎病因及发病机制是牙周病防治的主要任务。为了深入研究其发病机制及各种治疗方法的效果,需要建立一个模拟人类牙周炎的动物模型。因此,实验性牙周炎动物模型在牙周病的病因学、病理学以及牙周病防治方面的研究中起着十分重要的作用。本文就实验性牙周炎动物模型的研究进展作一综述。1牙周炎的动态模型牙周病尤其牙周炎是以牙菌斑为始动因子的多因素疾病。菌斑在牙周病的病因中起主要的基础和决定作用,诱发早期的炎症过程。而口腔卫生不良、牙合创伤等局部因素及内分泌障碍、免疫状态、遗传因素等全身因素,影响牙周病的发生发展。牙周炎的破坏过程是菌斑和宿主反应共同作用的结果,宿主的防御细胞在抵御外界病源微生物的同时,释放大量的细胞因子和炎症介质,参与了牙周组织的继发性损伤。所以,实验性牙周炎模型须具备促使口腔局部菌斑堆积形成和降低宿主防御能力的条件。仅单纯的局部菌斑形成因素,也可以建成牙周炎模型,但在局部与全身因素共同作用下,炎症的发生发展更为显著。2其它常见的牙周病研究动物建立实验性牙周炎的动物模型,可为探讨牙周炎的病因及临床过程提供实验依据。为了形成理想的实验性牙周炎动物模型,动物的选择尤为重要,所选用的动物不仅要求形体适中便于实验,而且由此得出的实验结果,要能够较好的反映或模拟人类牙周病的变化过程。牙周炎的易感动物种属很多,一般可选用大鼠、金黄地鼠、田鼠、豚鼠、家养雪貂、羊、小型猪、狗及非人灵长类(如猴等)动物。其中猴、狗、鼠较常用于牙周病动物模型的建立。猴为非人灵长类动物,牙式与人完全相同,除牙列大小差异,尖牙较大,切牙对刃牙合,前牙有间隙外,其牙体和牙周解剖、组织病理学、微生物学及免疫学等,都与人类有极相似之处,因此,猴是牙周病研究的首选动物。但由于价格较贵,繁殖慢,且属国家自然保护动物,不易购买,难以进行大规模的实验研究。狗的牙周组织结构和组织学表现与人类亦极为相似,也有乳牙和恒牙两副牙列。牙面上常有牙石沉积,尖牙、前磨牙的牙间隙宽,且价格适中,容易控制,是用于建立实验性牙周炎模型较理想的动物,尤其适用于各种牙周袋的研究。特别是使用Beagle犬用于牙周病的研究,为国外学者广为接受。大鼠口腔菌斑的形成及其生长发育、繁殖等都与人类相似,除了其切牙终生不断生长,不能进行研究外,大鼠磨牙牙周组织结构、组织病理也与人类近似,并且大鼠价格便宜,易于饲养,且成活率高。因此在牙周病的研究中,大鼠一直是最广泛使用的啮齿动物。金黄地鼠有和大鼠一样的牙式,切牙也可持续生长,张口度可达180°。地鼠感染菌斑细菌后,可表现出与大鼠相似的症状,如牙龈退缩及牙槽骨水平性丧失,也可用于牙周病的研究。小型猪的消化系统、骨骼结构及牙齿发育和牙周组织等都与人类有相似之处,也有乳牙和恒牙两副牙列,牙的大小与人类的近似,其价格适中,实验难度不大,可以作为牙周炎的研究对象。豚鼠也是较好的牙周病实验动物。豚鼠为啮齿动物,其切牙区牙周组织形态及组织学表现与人较为相似,且豚鼠性情温和,易饲养,对外界刺激敏感性高,更适于精神压力及应激对牙周病的影响方面的研究。家养雪貂也有乳牙和恒牙两副牙列,其口腔中的牙结石结构似羟基磷灰石,与人牙石的区别仅在于其钙化程度稍低,且饮食不影响其牙石的形成,因此尤其适于牙石的研究。此外,研究表明:羊的自发性牙周炎的临床特征、血清学特点及口腔微生物与人类牙周炎极为相似,所以羊也适于牙周病的研究。3牙周病动物模型的建立3.1牙槽骨丧失模型的建立采用结扎线法是较为成熟且被广泛应用的建立牙周炎动物模型的方法。此法操作简单,而且能在短期内造成牙周炎。结扎线作为一种菌斑形成的促进因素,容易造成菌斑的持续积聚、炎症细胞的持续浸润,从而造成牙周结缔组织破坏和牙周骨丧失。常用的结扎材料有细丝线、尼龙线、棉线、正畸用钢丝及弹性橡皮圈等。在牙周病的研究中,大鼠一直是最广泛使用的啮齿动物,丝线结扎法造成大鼠牙周炎也是目前公认的牙周炎动物模型之一。Achong等用肌内注射氯胺酮(44mg/kg)法麻醉Sprague-Dawley大鼠,在其上颌第二磨牙颈部结扎丝线,7d时出现急性炎症,伴有上皮溃疡,中性多形核白细胞(PMN)浸润,结缔组织崩解,并出现根面吸收。21d时,结合上皮根向迁移,大体及放射线观察均见第二磨牙牙周有中到重度的水平型牙槽骨吸收。Bezerra等置尼龙线于Wistar大鼠双侧上颌第二磨牙牙颈部,并在前庭处打结,以保证丝线位于腭侧龈下。发现第4天时开始出现牙槽骨丧失,7d时达到高峰。组织病理学示第一、第二磨牙区进展性单核细胞浸润,破骨细胞数目增加,并有严重的牙骨质和牙槽骨吸收。Kuhr等用5-0丝线结扎于大鼠上颌第二磨牙颈部,术后15、30、60d分别处死动物,发现15d时牙槽骨丧失明显,达200～300μm,而在30d和60d时骨丧失分别只有50～100μm和150～200μm。因此认为,明显的骨丧失发生在最初的15d内。随着时间延长,伴有骨的重新形成,骨丧失反而减少,作者认为此模型更适用于短期研究。有学者使用正畸用弹性橡皮圈结扎于猴上颌第一前磨牙、第一磨牙、下颌侧切牙颈部,每隔2周更换橡皮圈1次,以保证橡皮圈的弹性,2～3个月后实验牙牙周组织破坏,骨丧失明显,猴牙周炎模型建立。此外,Martuscelli等用丝线结扎法在Beagle犬上也成功地建立了牙周炎模型。作者在Beagle犬的下颌第一磨牙和第一前磨牙的近中和远中作一浅的切迹,以固定2-0结扎丝线,防止滑脱,每周观察结扎线情况3～4次,若丝线脱落需立即再置放,8周后,发现菌斑积聚量多,牙龈炎症明显,探诊出血,放射线检查有明显的骨丧失。3.2野生型伴放线放线杆菌在食物中的感染问题采用单纯在口腔及牙龈缘部位接种牙周炎可疑致病菌的方法也可建立牙周炎动物模型。Schreiner等用野生型伴放线放线杆菌(Aa)接种于大鼠食物中建立了牙周炎模型。在接种细菌前,为控制大鼠口腔固定菌丛,在饮水中加入20mg卡那霉素及20mg氨苄青霉素,连续服用4d,并在应用抗生素的后2d,给予大鼠1.2g/L葡萄糖洗必泰擦拭口腔。接种物为1g大鼠食物与1mL含有108细菌菌胞和30g/L蔗糖的PBS混合物,在喂食之前,禁食3～4h,以保证大鼠食用接种细菌的食物,连续8d后,改用硬的食物,防止切牙过度生长。接种后2、6、12周,在舌及口腔软组织表面拭子检查中,均发现有野生型伴放线放线杆菌的定植。作者采用ELISA法检测发现,大鼠血清中IgG抗体滴度水平明显增高,喂饲野生型伴放线放线杆菌大鼠的抗血清与溶菌产物反应强烈,12周时,放射线检查有明显的骨吸收。该作者认为,通过单纯把野生型伴放线放线杆菌接种于食物中,从而定植在口腔的过程更接近自然的感染过程,而通过直接注射或局部涂抹细菌建立的模型,缺乏疾病的初级阶段,忽略了基因在疾病发生中的重要作用。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS)成分,对牙周组织有很高的毒性,被认为是牙周炎症的重要病因之一。用脂多糖或内毒素诱导的牙周炎模型简便,可比性强,具有可重复性。Dumitrescu等从Wistar大鼠右侧下颌第一磨牙近中侧进针后,尖端移向远中,以保证注射含鼠伤寒沙门氏杆菌LPS(10μg/μL)的1μL盐水于第一、第二磨牙间的牙间乳头处。注射后3、7、10d分别处死动物,发现3d时无明显的骨丧失和破骨细胞数目的改变,而在7、10d时均出现骨丧失,破骨细胞数目和活性的增加,牙龈越隔阻胶原纤维破坏,结合上皮根向移位,Giemsa染色显示上皮及上皮下结缔组织内炎症细胞浸润,并出现牙间乳头火山口状破坏等类似人牙周炎症的组织学表现。因此,作者认为,注射后7～10d牙周炎模型建立。也有学者将大肠杆菌LPS(1mg/mL)10μL注射于大鼠上颌第一、第二磨牙之间颊腭侧的龈沟内,隔天在同一部位注射1次,连续3次,1周后见牙周炎模型建立,牙齿松动度增加,牙槽骨丧失,液闪光谱法测定牙龈组织中胶原酶和明胶酶活性增加。3.3性金黄地鼠食物通过制定牙周炎食谱,以达到菌斑堆积的目的。这种软食易黏附于牙面,且不利于牙齿自洁,从而促使菌斑的附着、堆积和滋生。给予6周龄雄性金黄地鼠以高糖食谱,也称致牙周病食谱(Keyesdiet2000),100g食物中包括蔗糖56g、全脂奶粉28g、全麦粉6g、酵母粉4g、肝粉1g、食盐2g、新鲜蔬菜4g,12周后诱导出牙周炎。组织学上显示第一磨牙区有牙周袋形成,袋内及根面有大量菌斑沉积,袋上皮内中性多形核白细胞浸润,上皮嵴深嵌于结缔组织乳头状突起之间,上皮下为炎症结缔组织,可见牙槽骨吸收。3.4牙颈部线粘结+高糖py历史损害法丝线结扎法用于动物是较为成熟的建立牙周炎模型的方法,而接种牙周可疑致病菌和高糖饲料喂养也是较为常用的方法。单独使用某种方法,存在着建立牙周炎模型可控性差的特点,而多个诱导因素的联用,可较快较好地诱导牙周炎的形成。Oates等放置接种有牙龈卟啉单胞菌(Pg)的丝线于猕猴双侧下颌前磨牙和第一、第二磨牙的牙龈沟内,并饲以软食,观察6周,发现牙龈指数显著增高,龈沟液(GCF)水平也明显增高,放射线检查在结扎组有显著的牙槽骨丧失,骨密度显著降低。生化参数中龈沟液Pyridinoline(PYD)水平在最先2周内即有显著增加,为基线值的35倍;骨碱性磷酸酶(BAP)水平为基线值的5～10倍,较未结扎组有显著增加。国内吴亚菲等选用5周龄SD大鼠,随机分为对照组、牙颈部丝线结扎+高糖(以100g/L糖水代替饮水)组(P1)、牙颈部丝线结扎+牙龈卟啉单胞菌+高糖组(P2)、牙颈部丝线结扎+牙龈卟啉单胞菌+具核梭杆菌+高糖组(P3)。在不同时间段进行微生物学及组织学检查,发现细菌均定植成功,且加入的细菌为大鼠牙周的优势菌。组织学结果显示,P1组在2周时形成龈炎,4周时形成较典型的牙周炎;P2组2周时表现为急性期牙周炎,4周时表现为慢性牙周炎;P3组病程与P2组相似,但病变程度更严重。研究结果提示:牙颈部丝线结扎+接种牙周可疑致病菌+高糖水在2周时就能成功诱导牙周炎的形成。此外,Nogueira等用丝线结扎法联合牙合创伤建立牙周炎模型,磨去雄性Wistar大鼠第二、第三磨牙的牙尖,但不致于引起牙髓损伤和暴露,以造成双侧第一磨牙牙合力过大,然后随机选取一侧下颌第一磨牙颈部结扎棉线,对侧作为对照。30d后,牙周炎模型建立。组织学上显示严重的骨丧失,并有根分叉病变。3.5牙周炎的病理变化内分泌障碍、免疫状态等全身因素,是牙周炎发生发展的促进因素,全身因素通常与局部因素联合应用以建立牙周炎模型。周秀青等分别给SD大鼠肌注糖皮质激素和(或)牙间接扎,结果发现结扎组大鼠出现牙间乳头溃疡及慢性炎症变化,牙槽嵴顶轻度吸收;激素组大鼠的牙槽骨呈骨质疏松改变,牙周组织无炎症;而在激素加结扎组则出现了牙间乳头溃疡坏死,牙周袋形成,慢性炎症细胞浸润,牙槽嵴吸收等牙周炎的病理变化。罗云纲等则将3月龄Wistar大白鼠随机分为对照组、激素组、结扎组、去势加结扎组。去势加结扎组的每只大鼠的上颌第一磨牙牙颈部用正畸钢丝结扎,并行双侧卵巢切除术,术后常规饮食,1周后拆线。激素组则在大鼠后肢股四头肌内注射地塞米松,每只1mg/d,以0.4mL生理盐水稀释,连续用药14d。结果发现激素组牙龈乳头炎症较轻,牙周膜未见明显变化;结扎组出现第一、第二磨牙牙间乳头糜烂坏死,牙槽嵴顶吸收,牙周袋形成等炎症性刺激变化;去势加结扎组,血液中雌激素明显下降,牙槽骨密度降低,牙槽骨吸收,牙齿松动,牙周袋形成等类似人类牙周炎的病理变化。所以,单纯全身因素的作用并不能形成牙周炎,局部刺激因素是致牙周炎的关键,全身因素可在局部因素的作用下促使病变加重,加速牙周组织的破坏。4一些特殊和刺激性牙齿周围炎的动物模型的建立牙周骨缺损的修复重建一直是研究的热门课题,采用手术方法建立各种牙周骨缺损模型,为研究牙周组织再生提供了可能和方便。4.1牙冠降到根方面Beagle犬术前晚禁食,戊巴比妥钠(20～30mg/kg,i.v)麻醉,并在手术部位作浸润麻醉。在下颌尖牙至第二磨牙的颊舌侧分别作沟内切口,翻开黏骨膜瓣,去除第三、第四前磨牙釉牙骨质界(CEJ)至根方的牙槽骨约6mm,并磨去根面牙骨质,拔除第一与第二前磨牙,将第一磨牙牙冠降至牙槽嵴水平,以减少牙合创伤。从而建立了第三与第四前磨牙骨上缺损模型,此模型可用于牙周组织再生的研究。4.2前磨牙的前磨牙Kim等用Beagle犬建立一壁骨下缺损,来研究移植材料对牙周愈合的影响。常规麻醉Beagle犬后,在实验性手术前2个月拔除下颌第一和第三前磨牙,使牙槽窝愈合。在实验性手术时,翻开颊舌侧黏骨膜瓣,在下颌第二前磨牙的远中面和第四前磨牙的近中面去除牙槽骨,平整根面,在缺损底部的牙根面做一切迹,形成4mm×4mm×4mm类似盒状的一壁骨下缺损。4.3度根叉缺损的形成Murakami等将Beagle犬麻醉后,翻开下颌第一磨牙黏骨膜瓣,去除颊侧骨组织,暴露根分叉,在根分叉处水平向去骨3mm,冠根向去骨4mm,用Gracey匙刮除根面牙骨质,形成Ⅱ度根分叉骨缺损,然后将乙烯聚硅氧烷印模材料放置在骨缺损处以诱发炎症缺损。复位缝合全厚瓣并覆盖根分叉缺损处,1周后