脓毒症患者的抗原识别受体研究进展

脓毒症患者的抗原识别受体研究进展

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征。定义基于以下两个临床表现：低体温或发热、心率减慢、呼吸急促、白细胞增多或减少或大于10%的法定红细胞。严重脓毒症(severesepsis)是指脓毒症的基础上伴有器官功能障碍、组织灌注不足(乳酸酸中毒、少尿、意识改变等)以及低血压。脓毒症休克(septicshock)是指脓毒症基础上对强力液体灌注反应差的组织灌注不足。脓毒症休克常导致多器官功能障碍综合征(MultipleOrganDysfunctionSyndrome,MODS),伴随有三个或以上器官的功能障碍及需要生命支持治疗方能维持的内环境紊乱。脓毒症ICU患者的主要死亡原因之一,总体死亡率大约为30%~40%,而在老年患者或是伴随有基础疾病的患者中死亡率超过70%。国内一项多中心流行病学调查显示,严重脓毒症在ICU的发病率为8.68%,死亡率高达44.7%,人均消耗医疗费用为11390美元,或每天502美元。国内外相关学者在脓毒症发病机制方面开展了大量的基础实验和临床试验研究,但是至今仍没有达到共识。传统认为过度的炎症细胞和介质激活是脓毒症导致脏器损伤的主要原因,但是近期国内外相关学者却发现,脓毒症期间淋巴细胞凋亡诱发的免疫抑制是脓毒症患者死亡的主要原因。由于脓毒症涉及到的分子机制极其复杂,本文仅对脓毒症患者的异常炎症反应及相应的治疗进展作一简要介绍。1脓毒症的炎症激活机制是什么1.1tlr和nlr相关分子类型和基因型判定抗原识别受体(PathogenRecognitionReceptor,PRR)是宿主对抗外界抗原的重要分子,包括Toll样受体(Toll-LikeReceptors,TLR)和寡聚化结构域样受体(OligomerizationDomain-LikeReceptors,NLR)。TLR识别微生物的抗原相关分子类型(Pathogen-AssociatedMolecularPattern,PAMP),从而启动先天性和获得性免疫反应。TLR和NLR还能识别内源性危险分子,这些危险分子也称为警报素或危险相关分子类型(Danger-AssociatedMolecularPattern,DAMP),包括热休克蛋白、纤维蛋白原、透明质酸和高迁移率组蛋白1(High-MobilityGroupBox-1Protein)等能引起炎症扩大的分子。然而TLR只能识别细胞表面或溶酶体、内涵体表面的抗原,而入侵至细胞胞内的抗原则被细胞质PRRs识别,其中包括NLR。NLR根据氮端结构域的不同被分为不同亚型,氮端为热蛋白结构域的NLR(NLRP)是其中最大的一组成员。NLRP3被PAMP或DAMP激活后可激活下游的Caspase-1,从而诱导IL-1β和IL-18的合成,这些细胞因子在过度炎症中的脏器损害有关。因此,TLR和NLR一方面抵御外界抗原的入侵,另一方面也介导了过度炎症对组织脏器损伤的作用。1.2其他促炎因子细胞因子是指一类小分子物质,半衰期很短,仅为数分钟至数小时,但是在炎症过程中有着重要作用。脓毒症病程中它们的血清浓度可从pg/ml上升为ng/ml甚至是μg/ml。TNF-α和IL-1是研究最为广泛的促炎因子之一,可介导其它多种促炎因子的激活。与脓毒症相关的其他促炎因子包括IL-6、IL-12、干扰素-γ、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1和粒细胞集落刺激因子等,其中IL-6同时具有促炎和抗炎性质。IL-17家族的促炎性质是近期才被发现的,由Th17细胞合成与分泌,能刺激其他促炎因子的合成,如IL-1β、IL-6和TNF-α等,同时还能介导淋巴细胞和巨噬细胞间的交互作用。IL-17A对脓毒症的发生于发展具有重要作用,实验研究显示,阻断IL-17A能减轻菌血症、降低全身促炎因子水平及提高生存率。总体而言,脓毒症病程中细胞因子是一个极其复杂的网络,包括促炎细胞因子、抗炎细胞因子和促炎细胞因子的可溶性抑制剂。这个网络的平衡决定着细胞因子网络的促炎能力。1.3mif在髓炎治疗癌毒症中的作用人类机体内还有多种炎症介质参与炎症的激活,包括巨噬细胞迁移抑制因子(MacrophageMigrationInhibitoryFactor,MIF)、HMGB-1、髓样相关蛋白(Myeloid-RelatedProtein,Mrp)、骨髓细胞表达的可溶性触发蛋白(SolubleTrigerringReceptorsExpressedOnMyeloidCells-1,TREM-1)等。MIF是一类促炎细胞因子,是先天性免疫反应的重要调节因子。很多组织或细胞都有MIF的表达,如肺、胃肠道、T和B淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等。MIF通过调节TLR4影响着先天性免疫反应。MIF表达缺失小鼠接受脂多糖(LPS)刺激后TLR4的表达水平显著低于野生型小鼠。近期研究发现,脓毒症时MIF的血清水平显著升高,且对脓毒症死亡率有早期预警的作用,MIF抗体对脓毒症也有一定治疗作用。然而MIF基因多态性研究却发现,对应着高MIF表达的基因型在社区获得性肺炎患者中表现出有益作用,这也提示我们临床上不能应用MIF抗体治疗脓毒症,以防得到相反结果。HMGB-1蛋白是脓毒症的晚期介质,在大部分脓毒症患者中会升高。它由激活的免疫细胞合成,可与TLR-2和TLR-4发生关联,从而启动与LPS类似的促炎反应。HMGB-1还会引起凝血因子和中性粒细胞的聚集。与促炎细胞因子IL-1等相比,LPS刺激HMGB-1的释放发生于相对较晚的阶段。尽管HMGB-1在严重脓毒症患者中升高,但是其对脓毒症的预后并没有预测意义。向小鼠注射HMGB-1是致命的,而HMGB-1抗体对内毒素和盲肠结扎穿孔小鼠具有一定治疗作用,因此HMBG-1可能是脓毒症治疗的新靶点。Mrp是S100家族的成员,Mrp8和Mrp14形成的异二聚体可引发一系列炎症反应,该复合物可通过聚集炎症细胞扩大内毒素引发的炎症损伤。同时,它还是TLR4的配体,其中Mrp8是激活TNF-α的活性组分。在脓毒症患者及注射LPS后的健康志愿者中,Mrp8/14复合物水平显著升高。在腹腔脓毒症中,Mrp14介导了细菌扩散和肝脏损伤的作用,同时,Mrp8/14缺失对脓毒症小鼠具有保护作用。TREM-1主要位于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮和上皮细胞,对炎症信号具有重要扩大作用,其能协同性地增强PRR激活后的细胞反应,而单独激活TREM-1仅引起轻度的炎症反应。TREM-1阻断能抑制炎症并对脓毒症动物有治疗作用。炎症与感染过程中TREM-1可以可溶性成分被释放至循环中,脓毒症可溶性TREM-1的升高与较差的预后具有相关性。1.4炎性抗体与炎性体抗凝活性系统性炎症激活的危重病患者往往发生凝血功能障碍,包括凝血系统的激活、以及抗凝系统和纤溶系统的抑制。凝血系统的激活主要表现为血浆可溶性组织因子、凝血酶原片段F1+2、凝血酶抗凝血酶复合物(TATc)水平升高,以及凝血因子消耗造成的PT和APTT延长。同时,脓毒症还伴随着抗凝因子蛋白C、蛋白S和抗凝血酶水平降低。纤溶系统则表现为组织类型纤维蛋白溶酶原活化因子、纤溶酶活化抑制因子-1(PAI-1)、纤溶酶/抗纤溶酶复合物(PAPc)和D-二聚体的升高。脓毒症患者促凝系统的激活往往对应着死亡率的升高。多项证据表明,炎症反应与凝血功能密切相关,炎症反应可激活凝血功能,同时凝血功能又影响着炎症反应的活性。在严重脓毒症中,炎症诱导的促凝状态往往是有害的,可能导致弥散性血管内凝血(DIC)和血管内血栓形成,介导这一过程的主要炎症因子包括TNF-α、IL-1和IL-6。然而,尽管抗TNF-α抗体在动物实验中对脓毒症有治疗作用,但是该抗体并不能阻断促凝系统的激活。因此,脓毒症的死亡率与促凝系统的激活并不一定相关联。1.5炎反应系统补体系统由近30种血浆蛋白质和受体组成,可被经典途径、旁路途径或凝集素结合通路激活。补体系统是一类促炎反应系统,可调理入侵抗原、增强抗体反应、溶解外源性细胞、清楚凋亡细胞和刺激化学趋向性,从而将先天性与获得性免疫反应联系起来。脓毒症可引起补体系统过度激活,血浆C3a、C4a和C5a水平显著升高。静注C5a抗体可提高脓毒症大鼠存活率,阻断C5a可减少过度炎症的害处,同时保留宿主防御体系中补体系统的作用。2细胞活力检测为了将脓毒症病程中炎症过度激活的实验研究应用到临床治疗上,国外学者试图应用大剂量激素或细胞因子抗体下调脓毒症病程中过度激活的炎症反应。但是遗憾的是,几项大规模临床试验并未得到阳性结果,这提示我们脓毒症是否还存在其他发病机制。实际上,脓毒症更易发生于年轻患者与老年患者,以及并发多种疾病的患者。由此,Bone等提出了代偿性抗炎反应综合征(CompensatoryAntagonisticResponseSyndrome,CARS)的概念,在初始的爆发性炎症反应过后,逐渐诱发抗炎反应,从而使患者受害于继发性感染或对治疗干预无效。代偿性抗炎反应包括抗原递呈无效、T淋巴细胞低反应性、Th1细胞增生降低,这种状态也成为免疫麻痹(immunoparalysis),其主要原因在于免疫细胞凋亡,如淋巴细胞、树突状细胞和上皮细胞。免疫细胞凋亡的机制极其复杂,涉及到多条凋亡通路及不同细菌诱导的宿主反应。2.1自体咀嚼形成的细胞凋亡细胞的死亡方式包括坏死、凋亡(1型细胞程序性死亡)和自体吞噬(2型细胞程序性死亡),其中自体吞噬作用往往是可逆的。坏死过程中,细胞表现为胞浆肿胀、细胞器结构紊乱、细胞膜破裂和核溶解。而细胞凋亡的标志为染色质聚集、核裂解和凋亡小体形成。凋亡小体包含完整的细胞膜和细胞器。自体吞噬是指细胞成分的自我降解,以循环利用或消除过多的细胞内物质,如同饥饿状态一样,自我吞噬作用可以保存细胞的生命。自体吞噬的特点在于自体吞噬体的形成,即吞噬细胞质和细胞器的大双膜囊泡。自体吞噬体会与溶酶体融合被降解,不损伤细胞且不引发警示信号。当细胞自体吞噬能力达到极限时,细胞则会发生凋亡。细胞死亡的三种方式在机制上是有关联的。例如,线粒体可启动自体吞噬、凋亡或坏死,结果引发的细胞死亡通路依赖于钙离子、无机磷和游离脂肪酸等因子诱发的线粒体通透性改变。线粒体通透性改变可引起ATP耗竭、线粒体水肿及外膜破裂。如果通透性改变轻微,自体吞噬程序可在进一步损伤发生之前循环利用线粒体。一旦细胞色素C和其他凋亡分子被释放到细胞质,如凋亡诱导因子(AIF)、第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂/低等电点IAP直接结合蛋白(Seconditochondria-derivedactivatorofcaspase/DirectIAP-bindingprotein,Smac/Diablo)和pro-Caspases-2、3、8、9等,细胞凋亡通路则被启动。而ATP急剧下降则会导致细胞膜破裂、细胞内酶外露,从而引起细胞坏死。2.2细胞外其它分子细胞引起的炎症反应至今仍未得到很好地诠释。损伤的细胞释放大量危险信号分子,其中部分会被受体识别,激活促炎介质的合成。脓毒症时细胞坏死诱发的炎症反应机制极其复杂。细胞坏死时胞内储存的细胞因子可能被释放出来从而诱导炎症反应,但是细胞因子仅储存于某些特定细胞内,对于大部分细胞来说,可能存在某种其他分子可介导炎症的发生,如HMGB1、尿酸、热休克蛋白、DNA染色质复合物和抗微生物肽等。HMGB1是核蛋白的组成部分之一,结合于DNA并调控基因表达。其主要由坏死细胞释放,而不是凋亡细胞,可刺激单核细胞释放TNF-α。尽管应用抗HMGB1抗体可降低细胞坏死引起的炎症,缺乏HMGB1表达的细胞坏死时仍可诱导炎症的发生。尿酸是细胞内分子,其生物活性物质为一钠尿酸盐,IL-1β的强有力诱导剂。细胞坏死引起的炎症反应还与某些特定受体相关。TLR-3是病毒双链RNA受体,可促使巨噬细胞识别坏死的中性粒细胞,从而刺激促炎细胞因子的合成。巨噬细胞诱导的C型凝集素也是这样一类受体,可识别非正常细胞死亡,诱导促炎反应,从而促使中性粒细胞迁移至坏死组织。2.3死亡受体下游通路细胞凋亡在脓毒症中的地位非常重要,因为在感染过程中其会影响免疫细胞。细胞死亡影响着宿主的感染应激反应,因此也是经过严密调控的,而Caspase则是其中至关重要的调控点。至今已被发现的Caspase已有十余种,其中有2/3参与了凋亡的调控。Caspase是细胞凋亡过程中被激活的半胱氨酸蛋白酶,从昆虫到人类都高度保守。未激活状态的Caspase由三部分组成:氮端区域、p20和p10域。成熟的Caspase包含两个p20/p10异二聚体和两个活性区域。激活的Caspase分裂开来并与未激活的细胞内成分结合,如DNA合成、修复酶、MDM2(p53抑制剂)、细胞周期调控物质、细胞骨架蛋白和蛋白激酶Cδ等。细胞凋亡过程中Caspase的激活方式有三个通路:死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路。死亡受体通路也称为外源性通路,起始于细胞膜上的配体结合和受体寡聚化。其中配体包括Fas和TNF-α等。最常见的死亡受体为CD95(Fas或ApoⅠ)和TNFRⅠ(p55和CD120a)。死亡受体下游通路根据细胞类型、遗传背景和环境因素的不同而呈现出不同生物学功能,如炎症等。一旦Fas(CD95)被激活,其可召集Fas相关死亡区域(Fas-AssociatedDeathDomain,FADD)以形成膜结合复合物。随后Procaspase-8也被激活,该内源性蛋白酶的活性即使很低也可以激活多种分子,最终激活Caspase-3,从而启动细胞凋亡程序。然而,TNFRⅠ寡聚化可激活RIP1、TRADD、TRAF2和Ciap1以形成复合物Ⅰ,诱导下游通路激活NF-κB迁移至核内。随后,RIP1、TRADD和TRAF2分离出来,TNFRⅠ再激活FADD和Caspase-8形成复合物Ⅱ,从而启动细胞凋亡程序。线粒体通路是被细胞应激激活的,通过激活Bcl-2家族的促凋亡成员启动凋亡程序,如Bim、Noxa、Puma、Bid和Bad等,同时,抑制Bcl-2的抗凋亡成员,如Bcl-2、Mcl-1和Bcl-XL等,促使Bax和Bad寡聚化。Bcl-XL的三维结构与细菌的穿孔毒素非常相似,同时也有研究显示,Bcl-2、Bcl-XL和Bax可形成离子通道。激活的Bax和Bad在线粒体膜上形成孔道促使促凋亡物质释放至细胞胞浆中,如细胞色素C、Smac/Diablo、IAP、AIF、Omi/HtrA2和核酸内切酶G等。细胞色素C被释放至细胞质后可激活Caspase-9,同时与APAF-1、dATP结合,形成凋亡体复合物,最终激活Caspase-3,即内源性和外源性凋亡通路的交汇点。Smac/Diablo则通过与抗凋亡物质IAP家族结合间接诱导凋亡。IAF和核酸内切酶G诱导凋亡是通过Caspase依赖性通路实现的。另一方面,抗凋亡蛋白质Bcl-2、Bcl-X和Akt可维持线粒体的完整性,阻止促凋亡分子的释放。内源性和外源性通路有时可发生关联,Caspase-8可将Bid分裂为t-Bid,促使其转移至线粒体膜诱导Bax的寡聚化。内质网通路是指未折叠蛋白质聚集物的累积和过剩蛋白质发生迁移时诱发的细胞凋亡,涉及到的蛋白质包括Caspase-12。但是Caspase-12的作用至今仍有争议。Caspase-12可被钙离子和氧化应激激活,同时其可以激活Caspase-3、8和9,这些均为细胞凋亡密切相关的蛋白质。但是,Caspase-12缺失小鼠在脓毒症中却表现出更强清除细菌的能力,脓毒症小鼠存活率升高。因此,Caspase-12的作用仍有待进一步研究。2.4组织蛋白酶激活尽管大部分细胞凋亡涉及到Caspase通路,仍有少部分例外。例如主要存在于溶酶体中的组织蛋白酶(Cathepsin)即可诱导非Caspase依赖性凋亡,其中包含多种不同机制。正常情况下组织蛋白酶以非激活的形式储存,一旦被释放到细胞质之后即被激活,催化多种生命必需物质的分解反应,从而启动凋亡。溶酶体的通透性可被多种机制破坏。例如TNFRⅠ激活可诱导鞘氨醇合成,从而导致溶酶体破裂。活性氧自由基也可导致溶酶体泄露。组织蛋白酶还可以直接造成线粒体损伤,促使细胞色素C释放和Bid、Bax激活。值得注意的是,适度的溶酶体破裂可诱导细胞凋亡,而严重的溶酶体破裂则直接导致细胞坏死。3细胞癌毒症的治疗尽管目前对脓毒症的发病机制已有部分了解,但是在治疗上仍未取得重大突破。目前已用于临床的各种治疗方案在一定程度上提高了脓毒症的治愈率,如液体复苏、广谱抗生素、机械通气、糖皮质激素、强化胰岛素治疗和重组人类活化蛋白C等,但是严重脓毒症的死亡率仍居高不下。3.1糖皮质治疗髓炎的临床治疗经验糖皮质激素是最早被人类尝试应用于脓毒症治疗的药物,其可抑制先天性免疫反应,从而降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和γ干扰素(IFN-γ)等促炎因子的合成与释放,同时升高抑炎因子IL-10水平[61~63]。在动物实验中糖皮质激素可改善致死性脓毒症的预后,然而早期的部分临床试验却显示糖皮质激素可引起高血糖和严重的免疫抑制。这些试验的Meta分析显示,糖皮质激素对脓毒症患者表现出有害作用。在部分病例中,糖皮质激素增加二重感染的发病率与严重程度。这是因为糖皮质激素可诱导肠道上皮细胞和淋巴细胞凋亡,从而引起严重的免疫抑制。然而近期研究显示,糖皮质激素对于肾上腺功能和糖皮质激素反应功能低下的患者而言是有益的。肾上腺功能低下在脓毒症患者中很常见,在脓毒症休克中发病率可高达50%。炎症因子如TNF等可抑制肾上腺皮质醇释放,导致肾上腺功能低下。给予肾上腺功能低下的脓毒症患者氢化可的松或氟氢可的松治疗可使严重脓毒症患者存活率升高10%。因此,与传统短期大剂量激素治疗相比,持续生理剂量糖皮质激素对肾上腺功能低下的脓毒症患者是有益的。但是,长期糖皮质激素的治疗仍有导致免疫抑制的风险,这与糖皮质激素剂量与应用时间有关。3.2胰岛素的活性高血糖与胰岛素抵抗在危重病患者中很常见,包括脓毒症,即使该患者没有糖尿病的基础。高血糖对危重病患者非常不利,其可能导致凝血机制异常、诱导细胞凋亡、降低中性粒细胞功能,从而升高伤口感染几率、延迟伤口愈合,是死亡率升高的独立危险因素之一。相反地,胰岛素具有抗炎、抗凝和抗凋亡等活性。一项大型随机对照临床试验结果显示,利用强化胰岛素治疗将危重病患者血糖控制于80~110mg/dL与血糖超过215mg/dL的患者相比死亡率可降低约50%。强化胰岛素治疗带来的其他益处包括降低全身性血液感染、需要透析的急性肾功能衰竭、输血的发生率及机械通气的时间。此外,强化胰岛素治疗还可降低血清C反应蛋白水平(CRP)。3.3凝血成网反应人类重组活化蛋白C(ActivatorProteinC,APC)是美国食品与药物管理局(FDA)唯一批准用于脓毒症治疗的药物。蛋白C是由肝脏合成的急性期血清蛋白酶原,是凝血蛋白酶瀑布反应的最终产物。APC可水解凝血因子Ⅴa和Ⅷa