珍稀濒危药用植物冰山石斛研究进展

珍稀濒危药用植物冰山石斛研究进展

霍山石雕俗称米石斛，是一种多年生草本植物。主产于大别山区的安徽省霍山县,河南省也有分布。大多生长在云雾缭绕的悬崖峭壁、石缝隙间和参天古树上。据中国历代本草书目明确记载,霍山石斛性微寒,味甘、淡,具有益精强阴、生津止渴、补虚赢、除胃中虚火之功效。现代研究表明,霍山石斛含有石斛多糖、石斛碱、蛋白质以及人体所需的20种氨基酸等多种药用成分;从而具有生津益胃、明目、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等多种功效。因此,霍山石斛享有“中华仙草之最”的美誉。由于特殊的生长环境,霍山石斛的野生资源已濒临灭绝,但其显著的药理作用和生物活性吸引着大批学者对其各种特性展开研究。1生物学特征1.1茎、叶、生长结果物为5月法霍山石斛为多年生草本植物,深绿色,植株矮小,高2.5～7.5cm,数株成团,茎直立略有弯曲,老茎黄绿色,少数红棕色,当年新茎嫩绿色,成圆锥型,少数圆柱形,茎长5～10cm,4～5节;老茎一般无叶片,1～2年生茎上部有叶3～4片,互生、叶面深绿色;叶片长卵状披针形,长约2～3cm,宽0.5～0.7cm;5月开花,黄白色,大多一朵,顶生或腋生;7～10月结果,果实呈三角状圆锥形。霍山石斛喜阴凉湿润,通风多雾的小气候,忌高温、干燥、强光和长日照。一般生长在海拔250～1200m的傍水岩石上或附生树上,多长于河间山谷旁峭壁上,大多与苔鲜、石苇和地衣等低等生物附生在一起,常形成小群落,生长环境中需有根生菌存在,年平均气温18～23℃之间,空气相对湿度为80%以上为好。1.2石斛属植物的鉴定植物生长的物质基础来自光合作用合成的碳水化合物,因此,光合作用能力的高低决定了植物生长速度。研究表明,一些兰科植物的光合作用有景天酸代谢(CAM)途径。有的石斛属植物已被确认为CAM植物。苏文华等对铁皮和金钗石斛碳代谢途径的研究发现,两者均是兼性景天酸代谢植物,随着环境条件的变化,光合作用可在CAM途径与C3途径间变化。蔡永萍等对霍山石斛的碳代谢途径进行研究,得出的结论和苏文华等对金钗石斛、铁皮石斛的报道一致,即霍山石斛是兼性景天酸代谢植物。有专家推测霍山石斛这种特殊的光合特性可能是其生长缓慢的原因之一,也可能是其在强光下减轻光抑制的积极反应。但这些推论都缺乏具体的试验论证,还有待进一步研究。2无性繁殖和繁殖技术2.1研究复繁术,增加自然产量霍山石斛种子无胚乳,在自然条件下萌发率极低。加上常年无节制采掘,野生资源日渐枯竭,自然产量不能满足目前市场需求。因此,研究和繁育霍山石斛试管苗已经成为挽救这一濒危植物、增加其产量的重要途径。关于霍山石斛组培繁殖技术中的关键环节,学者们也已进行了大量研究,如外植体选择、培养基种类和含量、培养条件等。2.1.1山石斛种子萌发技术的研究霍山石斛快繁过程中,外植体类型对其诱导效果有很大的影响。一般可选择种子、假鳞茎段、茎尖、幼叶尖和花梗腋芽等,通过器官发生型或原球茎发生型2种途径,获得可迅速增殖的原球茎、拟原球茎或丛生芽。霍山石斛种子在自然界难以萌发,但在无菌培养基上,种子萌发率很高。但由于受种子来源的限制,许多学者逐渐转向以霍山石斛野生苗或无菌种子实生苗的茎节、茎尖以及种子原球茎为材料,诱导再生不定芽,以实现试管苗的大量繁殖。谭云等以霍山石斛假鳞茎为外植体,研究其对拟原球茎和丛生芽诱导的影响,结果显示假鳞茎下段的诱导率最高,可能是由于石斛基部具有较强的分蘖能力。金青等以霍山石斛试管苗带节茎段为材料,诱导产生类原球茎,并研究类原球茎发育过程。种子原球茎是诱导形成类原球茎的最好材料。用霍山石斛类原球茎制作的人工种,其萌发率可达90%,萌发的幼苗存活率为80%,说明类原球茎具有很强的分化能力。2.1.2培养基的种类和含量选择适宜的培养基对霍山石斛的增殖和分化至关重要,且在不同的生长阶段所需的培养基种类、激素的种类和含量、有机附加物的种类和含量都不尽相同。常用培养基有MS、Nitch、KnudsoC(KC)、N6等。大批学者对霍山石斛快繁的培养基配方进行了研究,代表性的培养基如表1所示。2.1.3不同温度对霍山石斛生长和继代增殖的影响除了外植体、培养基、激素和外源添加物影响外,温度、光照以及pH值等也会影响霍山石斛原球茎或幼苗的发生及发育。霍山石斛种子在培养初期需较高的温度,在25℃左右萌发生长较快;低于10℃时,即使营养条件满足也不能萌发。霍山石斛的试管苗生长和继代增殖的最佳pH值为5.4;其最适培养条件为温度(25±2)℃,光照强度为1600～2000lx,光周期为8～12h/d。霍山石斛快速繁殖的成败与培养介质、培养条件等诸多因素有关。安徽圣农生物科技股份有限公司结合研发和生产实际,研制出了适合霍山石斛快速繁殖的最佳条件,这为霍山石斛的产业开发奠定了基石。2.2新技术的开发2.2.1驯化锻炼及炼苗组织快繁的试管苗成功进行大田移栽和生长,是实现霍山石斛野生资源人工再生的关键。新形成的霍山石斛试管苗较为弱小,根系也不发达,不适宜田间移栽。为了提高试管苗对外界环境的适应性,提高其光合作用的能力和移栽成活率,需要进行移栽前的驯化锻炼及炼苗。具体方法:将长有完整试管苗的容器由培养室转移到半遮阴的自然光下进行锻炼,在自然光下恢复植物体内叶绿体的光合作用能力和健壮度,并打开瓶盖注入少量自来水使幼苗逐渐降低温度,转向有菌环境,这样幼苗周围的环境就会逐步的与自然环境相似,从而提高霍山石斛试管苗的存活率。2.2.2化学成分栽植胡天放采用石栽法,将霍山石斛栽培在富含腐殖质的沙壤土上,并覆盖青苔绿藓,首次实现了霍山石斛的人工移栽,这为以后的相关研究指明了方向。随后很多学者对霍山石斛栽培的时间、栽培方法和栽培条件等进行了研究。具有代表性的研究成果如表2所示。3解决研究中存在的问题和解决方案3.1化学成分及刑事应然药物霍山石斛独特的药理作用是由其化学成分决定的。但到目前为止,由于霍山石斛数量稀少、价格昂贵,且受分离技术限制,国内外对霍山石斛化学成分的研究较少。人们只是通过其他药用石斛的化学成分来推断霍山石斛的化学成分,随后利用仪器检测加以验证。如20世纪90年代,安徽农业大学的学者们通过与其他2种石斛比较,对霍山石斛不同生长期内总生物碱、微量元素和氨基酸含量以及它们在生物体内的分布规律进行了较为系统的研究。此外,许多学者还对霍山石斛中的多糖进行了研究。如测定霍山石斛中多糖的总含量,优化多糖的提取工艺;研究稀土元素、化学物质等对霍山石斛多糖含量的影响等。查学强和Hsieh等还从霍山石斛中分别分离出一种具有免疫活性的均一性多糖单体。至目前为至,人们对霍山石斛药理作用的认识一直根据历代本草中的记载和医家的临床经验。近几年对霍山石斛化学成分研究的发展为其药理学研究提供了科学依据。合肥工业大学罗建平教授的课题组多年来一直从事霍山石斛药理学研究,发现霍山石斛多糖具有增强机体免疫活性、抗氧化活性、抑制白内障形成和发展的药理作用。此外,陈风芹等的研究亦表明霍山石斛提取物具有较好的抗氧化作用。对霍山石斛化学成分及其药理作用的研究虽然取得了一定的进展,但霍山石斛中存在活性物质的数量、种类、结构鉴定、含量以及生物活性等问题还有待相关科研工作者的进一步研究。借助现代先进仪器分析技术,结合前人对石斛属植物化学成分的分离经验,笔者认为可以从以下几个方面对霍山石斛的化学成分及药理作用进行研究。(1)将各种先进的分离技术和检测仪器运用到霍山石斛化学成分的分离和鉴定中,如凝胶色谱,HPLC、液-质联用等。如石斛多糖的分离,常用的硅胶柱层析难以达到预期效果,需借助HPLC等其他分离手段。(2)活性化合物及其衍生合成。对活性成分进行提取分离,结构鉴定等,并对有效部位的活性大小以及活性化合物的生源合成途径进行研究,以获得大量的活性物质;并可在此基础上以活性成分为先导化合物,对其进行结构修饰和改造,以期发现活性更高的化合物。(3)化学成分和生物活性研究的紧密结合。研究已知化合物的未知生物活性和新化合物的各种生物活性,探索活性成分的作用机制和构效关系。3.2两种内生菌的研究植物内生菌是指那些在其生活史中的某一段时期生活在健康植物组织内部,且对植物组织没有引起明显病害的菌类。研究表明,内生菌因长期生活在植物体内的特殊环境中,与宿主协同进化,从而使其具有许多特定的功能,如促进宿主植物生长或增强抵抗力,产生植物激素、抗生素或其他具有特殊生物活性的物质,产生与宿主相同或相似的活性物质等。霍山石斛种子萌发和植株的生长发育都需要依赖与之共生的内生真菌。因此,研究霍山石斛内生菌及其代谢产物,以及其与寄主植物的相互关系具有重要的意义。目前,仅有安徽农业大学的王娣从霍山石斛根部分离出3株内生真菌,并研究了这3株内生真菌对霍山石斛生长的影响。除此之外,还未见有关霍山石斛内生菌的报道。因此,对霍山石斛内生菌进行研究与开发是发展霍山石斛产业的重要组成部分,其前景也十分广阔。从内生菌研究现状,结合霍山石斛本身的特点,笔者认为可以从以下几个方面进行深入研究。(1)尝试从霍山石斛各个部位中分离内生菌,并获得一些有效的分离和检测内生菌的方法。(2)从分类学的角度研究霍山石斛内生菌及植物的整个微生态环境,丰富菌种资源库。(3)筛选出能产生与宿主植物相同或相似生理活性成分或其他新的活性成分的内生菌,并进一步的开发利用。(4)研究霍山石斛内生菌的促生作用及其机制。(5)运用分子生物技术寻找霍山石斛内生菌中相关的功能基因,进一步选择并克隆其相关功能基因进行表达,以便高效大量地获得这些生理活性成分;此外也可将霍山石斛内生菌作为外源基因的载体,将某些基因导入到内生菌中,这样既可以提高宿主植物的抗性或产生某种特殊活性物质的能力,又保持了植物本身的基因和天然性状。4进一步研究和探讨问题霍山石斛在我国的应用有着悠久的历史,但对其较深入的研究却只有几十年的历史。现阶段对霍山石斛的研究和应用主要集中在快速繁殖和种植方面。随着相关技术的发展,通过器官、组织和细胞的大规模培养,工业化定向生产霍山石斛已经得到逐步实施。但是在取得重大科技成果的同时,也存在一些问题,需要进一步研究和探讨。(1)当前霍山石斛组培快繁技术虽然取得了重大突破,但距离实现真正的产业化,形成完整的霍山石斛开发产业链还有很长的路要走。特别是试管苗的移栽、深加工产品开发、产销体系的建立等方面的问题亟待解决。