反刍动物瘤胃微生物区系研究的回顾与展望

反刍动物瘤胃微生物区系研究的回顾与展望

反刍动物瘤胃有几种复杂、多样和不受影响的微生物，如肿瘤细菌、厌氧菌和纤毛虫，以及少量寄生虫。幼畜出生前，其消化道内并无微生物，出生后从母体和环境中接触各种微生物，但是经过选择，只有少数微生物能在消化道定植、存活和繁殖，并随着幼畜的生长和发育，形成特定的微生物区系。因此，反刍动物瘤胃选择了其特定的微生物区系，这些微生物选择了瘤胃的环境，这种选择最典型的例子是只有反刍动物和单胃草食动物消化道才有厌氧真菌。研究瘤胃微生物的目的，是为了了解它们的形态、生理、繁殖、分布、种群之间相互制约及与宿主间的相互依赖关系。近年来通过反刍动物胃肠瘘管技术，瘤胃微生物的分离、培养和分子生物学研究以及瘤胃生态的人工模拟等技术，希望更多地掌握瘤胃代谢和微生物相互之间的关系，为合理应用饲料，开辟新的饲料资源提供帮助。1瘤胃纤毛虫的形态、生理和区系划分的研究从1843年Gubry和Delaford在反刍动物的瘤胃内发现微生物时起，一直延续到20世纪初，由于受到研究条件和技术的限制，许多研究者主要从事形态、分类的研究工作（Hungate,1966）。我国学者熊大仕早在20世纪30年代就开始这方面的研究，尤其对瘤胃纤毛虫的形态和分类进行了许多研究。1940年以后，瘤胃微生物在宿主内的消化作用才被证实。1948年，英国学者Elsden和Pillpson基于动物生理的研究，阐明了在反刍动物营养中微生物发酵产生挥发性脂肪酸的重要性。同一时期，Hungate等人在瘤胃微生物的形态、生理以及区系划分等方面做出了很大贡献。20世纪70年代以来，电子显微镜在微生物研究领域的应用使人们更深入地了解到微生物的亚细胞结构与功能之间的关系，并使过去在微生物系统分类方面存在的许多分歧得到了很好的解决。2新技术的应用近年来，随着各种技术的不断进步，反刍动物胃肠瘘管技术，瘤胃微生物的分离、培养和分子生物学研究以及瘤胃生态的人工模拟技术，瘤胃微生物发酵动力学研究，基于核糖体RNA为主的分子生物学技术等也得到了迅猛发展，这样就加快了环境生态下微生物区系结构的研究，一些不能培养的原来未知的微生物被发现，如大型瘤胃细菌Quinellaovalis从未培养成功，但经过核糖体RNA小亚基的基因序列分析而被确定分类地位（Krumholz等,1993）。同时，也可用这些新技术重新认识已知微生物。下面介绍几种分子生物学技术在瘤胃微生物多样性及分子生态学方面的研究进展。2.1srrna扩增核糖体RNA(rRNA)是生物在进化过程中很保守的大分子，因此可用作各类生物进化分类的依据。核糖体RNA分子有两种，细菌有小亚基（smallsubunitsuu）的16SrRNA和大亚基的5SrRNA、23SrRNA；真菌有小亚基18SrRNA和大亚基的5SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA。5SrRNA分子序列短，提供信息少，不适宜于生物分类。虽然23SrRNA和28SrRNA序列较长，可提供更多的信息，能更准确地研究系统发育分类及鉴定菌株，但是由于基因数据库中有关信息较少，难以进行比较分析。所以，用于研究细菌进化分类的通常是在基因数据库中注册数量较多的16SrRNA，对真菌则用18SrRNA。核糖体RNA分子可分为保守区和可变区，如细菌的16SrRNA有9个可变区。保守区可用作通用PCR的引物或可制成基因探针进行分子杂交和大类微生物（如古细菌、细菌和真核生物）的鉴别，如细菌固有的保守区可制成细菌的通用引物对部分或全部16SrRNA序列进行PCR扩增。可变区可制成选择性或专一性引物或探针进行属、种甚至株系的区分。这种技术采用的可以直接是rRNA也可以是rDNA，即编码rRNA的基因，其基本过程是，先提取微生物的总DNA或RNA，然后通过引物或探针，对rRNA某变化区域进行PCR扩增及序列分析或进行分子杂交，从而对微生物进行鉴别和系统发育上的分类。2.2微生物区系的研究16SrRNA方法的理论和实际操作前人已有大量的报道，研究者完善地建立了利用小亚基rRNA———16SrRNA研究胃肠道微生态系统的方法。这种方法也适用于23SrRNA,由于其信息量很大(3000bp)，故在技术更为成熟时，能得到更为广泛的应用。16SrRNA保守区的互补寡核苷酸可用来设计通用探针,而其可变区则用来设计成高特异性的探针,用来鉴定微生物的属或种,乃至某一菌株。Ogata等（1997）利用16SrRNA寡核苷酸探针研究牛瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)和多毛毛螺菌(Lacbnospiramultiparus)的数量与变化及其在复杂的微生物区系中的活性,结果表明,相关种的F.succinogenes具有遗传多样性，在该试验中,传统的培养计数法没有获得成功。群特异性的16SrRNA寡核苷酸探针可以用来研究不同家畜(牛、绵羊、山羊、猪)胃肠道中细菌、真核生物和古细菌的数量,试验发现，这三类微生物数量的变化范围分别为60%～90%、3%～30%和0.5%～3%，且发现不同动物消化道中占优势的甲烷菌是不同的。Krause和Russell(1996)利用探针研究了莫能霉素添加水平对瘤胃中氨基酸利用率及其脱氨基作用的影响,探针还被用于白色瘤胃球菌(Ruminlcoccusalbus)和黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)在发酵纤维二糖、纤维素及碱处理麦秸时细菌间相互关系的动力学研究。结果表明,16SrRNA寡核苷酸探针能有效地鉴定培养物中特定的细菌,而且还能提供细菌间竞争作用的一些信息。这些探针还被用来研究R.albus、R.flavefaciens和F.succinogenes在底物充足或不足的环境中对纤维二糖和纤维素的竞争现象。黄庆生等利用探针研究了酵母培养物对瘤胃细菌的影响,发现添加酵母培养物能显著提高黄色瘤胃球菌的相对比例。Finlay等利用荧光标记的16SrRNA寡核苷酸探针研究了瘤胃中的古细菌,证实内毛亚科(Entodinium)和反刍厚毛虫(Dasytricharuminantium)的细胞液泡外含有内共生的甲烷菌。Sharp等（1998）利用SSUrRNA探针研究瘤胃和体外连续培养系统中的微生物区系,均发现原虫和产甲烷菌之间有很强的互作关系。甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)是瘤胃古细菌中最大的一类,占89.13%,而且在99.12%的原虫碎片中均有发现,体外培养48h后,随着原虫数量的下降,甲烷杆菌科菌占古细菌的比例降为54%,但占古细菌12.11%的甲烷微菌科(Methanomicrobiale)细菌在原虫碎片中没有检测到,这说明甲烷微菌科细菌是游离在原虫外的。2.31药血生化指标运用PCR技术可以检测各种环境中的细菌，其灵敏度足以检测单个细菌。竞争PCR，即在PCR反应中再加入DNA内标，可进行定量分析。Reilly和Attwood(1998）利用16SrRNA基因的PCR研究了不同日粮条件下荷斯坦泌乳奶牛瘤胃中蛋白降解梭菌Clostridiumproteoclasticum的数量变化，结果发现，该菌在瘤胃中受日粮的影响不大，其数量在2.01×106～3.12×107个/ml之间变化。Koike和Kobayashi(2001）用特异性的竞争PCR分析比较了消化道食糜和纯培养中瘤胃纤维细菌数量计数的灵敏度。在纯培养条件下，产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的最低检测水平为1～10个细菌，而培养瘤胃食糜情况下，这些菌的最低检测水平为103～104个/ml。这三种纤维细菌在瘤胃和瓣胃中最多，皱胃和后肠中也能检测到，其中产琥珀酸丝状杆菌数量在消化道不同部位均为三者最高。一般认为，竞争PCR是一种快速、可靠的定量方法，而其灵敏性与16SrDNA探针特异性的结合更能对复杂的生态系统中的细菌群体数量进行定量检测。2.4srdna基因克隆随着基因克隆及PCR技术的迅速发展,核糖体RNA基因序列分析成为可能,从而促进了对复杂的微生物系统进行研究。目前，这种从16SrRNA基因的克隆、序列分析到系统发育分析的技术为环境微生态的研究提供了一条有效的途径。这种方法过去主要用于纯菌的鉴定上，为微生物的分类提供了可靠信息。近年来，被广泛地应用到肠道微生物生态系统的分析,目前有白蚁肠道、人类结肠和粪样微生物方面的研究（Okhuma和Kudo,1996;Wilson和Blitchington,1996）。Whitford等（1998）从饲喂全混合日粮(26%苜蓿、30%青贮玉米和35%精料)的奶牛瘤胃液中制备了两个基因克隆库,通过分析发现，133个序列中有101个与瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)是同源的,但大部分是以前从未培养或分离成功的细菌。Tajima等从饲喂全混合日粮牛的瘤胃液相、固相和饲喂高粗料(苜蓿、猫尾草)的瘤胃液中制备了16SrDNA基因克隆库,通过分析(161个克隆)发现，只有10个序列(6.12%)与已知的细菌一致34.16%的序列与已知细菌具有90%～98%的同源性,其余的与现在已知细菌的同源性均小于90%。与体内试验结果相反,体外培养得到的细菌与现在已知的细菌高度一致。Koike等（2001）利用该技术研究了绵羊瘤胃中附着在鸭茅和苜蓿秆上的微生物区系,结果发现91个克隆中有38个克隆与已知的细菌同源性低于90%。这些试验表明，有很多微生物在体外培养不能成活,从而得不到彻底的研究。目前利用该方法研究瘤胃中的原虫和真菌还不如细菌深入和成熟。Embley等（1995）通过分析多泡多甲虫(Polyplastronmultivesiculatum)和D.ruminantium的18SrRNA序列,对其进行了分类。Dore和Stahl(1991）通过对18SrRNA序列的分析和比较,将Neocallimastix属分类于壶菌纲(Chytridiomycete)；研究者还对四种瘤胃真菌进行了18SrRNA序列分析,数据与前人研究结果一致,而且还发现瘤胃真菌也具有同源性。以上研究发现了一些新的有用信息,但也有一些问题需要得到解决。这些问题主要体现在核酸的抽提、PCR及克隆过程中所产生的一些偏差和假象。例如,在数据库的建立过程中,由于检测手段的限制,将一些人工合成的序列录入了数据库,从而导致样品的基因克隆库和凝胶电泳图谱很难分析，甚至得出错误的结果。2.5电泳图谱分析虽然16SrDNA（或RNA）基因序列分析方法为微生态研究提供可靠的信息，但是由于克隆数量要求大，基因序列分析费时且成本高，因此不适用于如瘤胃这样复杂的微生态的研究，尤其是微生物区系变化规律的检测。近年来，DNA指纹技术（fingerprintingtechniques）迅速发展，变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）和温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技术受到微生态研究者的关注，为研究菌群结构及其动态变化提供了有效的手段。1993年Muyzer等首次将遗传指纹技术引入微生物生态学研究中，利用DGGE研究了环境中微生物区系的变化。利用DGGE和TGGE技术可以将长度相同但序列不同的DNA片段分开,其原理是在线性梯度变性或线性温度变性的聚丙烯酰胺凝胶上,DNA双链分子会逐步解链,迁移率也随之下降。DNA序列不一样,其解链的温度和所需的变性浓度也不一样,最终各种不同的DNA片段会在凝胶上呈现不同的条带,然后通过EB、SYBRGreenI或银离子染色即可成像,进而进行分析,通过对电泳图谱的直接分析可以对微生态系统中的各种细菌进行相对定量。该技术已经广泛地用来研究复杂的环境微生态系统、监测其区系组成变化、分离细菌、比较各种DNA抽提方法的效率以及检测PCR和克隆过程中产生的偏差等。但由于肠道系统中微生物种类繁多,产生的条带也多,而且很复杂,会对分析造成很大的困难,这在一定程度上限制了该技术在肠道生态系统上的应用。Cann等（1996）利用该方法纯化了瘤胃液中的纤维素利用菌F.succinogenes、R.albus和R.flavefaciens。DGGE图谱显示，R.flavefaciens9个菌株的16SrRNA的V3区经过PCR扩增后,在凝胶上处于同一个位置,这表明R.flavefaciens的16SrRNA的V3区没有多样性；R.albus则相反,9种菌株的该区呈现出高度的多样性。Ruminococcus两个种的电泳图谱与F.succinogenes有很大的不同,在电泳图谱上,可以很容易地将F.succinogenes、R.albus和R.flavefaciens的PCR产物区分开。这表明,DGGE可以将分类相近的菌株进行分离,故该技术可以用来分析瘤胃液中纤维素利用菌的多样性及其动态变化。Kocherginsdaya等（1997）利用该技术分析了饲喂不同日粮肉牛的瘤胃液微生物区系，提取总染色体DNA,扩增16SrDNA的V3或V9区,结果发现,饲喂干草日粮的肉牛其图谱相似，共出现了16条明显的带,其中5条占优势,但饲喂精料为主的结果与前者不同,每头牛的图谱都不一样。Zhu等（2001）利用DGGE分析了断奶仔猪粪样体外培养甜菜渣时细菌区系的变化情况,发现体外培养后,DGGE图谱的电泳条带会出现3条优势条带,通过16SrDNA的序列分析,这3种菌中两种与挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)和裂果胶毛螺菌(Lachnospirapectinoschiza)具有92%和96%的同源性,另外一