苦荞黄酮提取物的分离纯化及其抗氧化性研究

苦荞黄酮提取物的分离纯化及其抗氧化性研究

自由基是指具有独立存在的能力，包含一个或多个未成对电子的分子或分子的部分。由于自由基中含有未成对电子,因此大多数自由基都很活泼,具有高度的化学活性。在正常情况下,人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中,确保机体有效、正常的生命活动。自由基产生过多或清除过慢,它便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞,造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤,加速机体的衰老进程并诱发各种疾病,包括人体免疫功能的降低、衰老、癌症、肺气肿、老年性眼睛衰老(特别是白内障)以及炎症等。NO2-是一种对人体非常有害的离子,它可以与仲胺、叔胺在一定条件下形成强致癌物质亚硝胺。因此,在体内外清除亚硝酸盐或阻断亚硝胺合成是防治癌症产生的有效途径之一。苦荞(Tartarybuckwheat)也称鞑靼荞麦,是双子叶蓼科荞麦属(Fagopyrumesculentum)植物的成熟种子,是一种粮、饲、药兼用的植物资源。苦荞中含有人体中所需的多种营养成分,其中,类黄酮含量尤为丰富。现代医学研究表明,黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、防癌、抗突变、增强免疫力、杀菌、抗动脉粥样硬化、抗衰老等功能。因此,研究苦荞黄酮提取物的抗氧化活性及纯化对活性的影响具有一定的现实意义。本文以苦荞麸皮中提取的黄酮粗提物为原料,通过大孔吸附树脂进行纯化,得到苦荞黄酮精提物,以Vc及芦丁为对照,采用超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系、DPPH体系、H2O2体系及NO2-体系对苦荞黄酮提物体外抗氧化试验进行了研究,为苦荞麸皮的进一步开发利用提供一定的理论基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1苦荞黄酮的提取苦荞:2001年产于四川凉山彝族自治州川荞1号种子,用法国肖邦公司CD-1仿工业实验磨制粉,除荞麦壳外的所有部位全部收集,获荞麦全粉,将荞麦全粉在沸程为30~60℃的工业石油醚中浸提去脂,后以95%工业酒精提取,经旋转薄膜蒸发器浓缩、真空干燥得苦荞黄酮粗提物。1.1.2硫酸钠的合成DM-2树脂:山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂生产;芦丁、Vc、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、邻苯三酚、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺盐、亚硝酸钠、柠檬酸、碘化钾、硫代硫酸钠:分析纯;1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH):日本东京化成工业株式会社,分析纯。1.1.3fa2004电子天平UV-1700分光光度计:日本岛津;FA1004电子天平:上海天平仪器厂;KQ-600DB型超声波清洗器:昆山超声仪器有限公司;恒温水浴锅。1.2测试方法1.2.1苦荞黄酮精提物的制备在超声波辅助条件下,将真空干燥得到的苦荞黄酮粗提物溶于水中,过滤得清液,以一定的流速通过层析柱,然后用不同浓度梯度的乙醇溶液洗脱,分步收集,将洗脱液浓缩、干燥得到苦荞黄酮精提物。1.2.2o2-清除率在碱性条件下(pH=8.34),邻苯三酚发生自氧化反应,生成O2-·和有色中间产物,该有色中间产物在λ=322nm处有一特征吸收峰。当加入O2-·清除剂时,O2-·的生成受到抑制,邻苯三酚自氧化过程受阻,溶液在λ=322nm处吸收减弱。故通过测定A322值可以推断清除剂对O2-·的清除作用,并比较不同清除剂该作用的相对大小。具体操作为:25℃恒温条件下,在具塞试管中加入pH=8.34的66.7mmol/LPBS5.00mL、2mmol/L邻苯三酚0.2mL,加待测液0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL(不加待测液为对照),然后再加一定量缓冲溶液至体系总体积为9.00mL,并以二次蒸馏水作参比,邻苯三酚最后加入,然后立即迅速混匀,测定A322,每隔30s测一次直到反应启动后第6分钟,把所得的数据以时间为横坐标、A322值为纵坐标进行线性回归,得到的直线斜率为反应速率V空、V样。清除率按下式进行计算:O2-·清除率(%)=(V空-V样)/V空×100式中:V空──不加待测液时的反应速率;V样──加入待测液时的反应速率。1.2.3测定一元回收体系中a00-ax的活性体系中通过Fenton反应产生的·OH氧化水杨酸产生对510nm光有特征吸收的2,3-二羟基苯甲酸,通过测定水杨酸捕获·OH所得到的产物确定·OH的清除率。反应式如下:H2O2+Fe2+→·OH+H2O+Fe3+具体操作为:在25mL比色管中依次加入2mmol/LFeSO43mL、1mmol/LH2O23mL,摇匀,接着加入6mmol/L水杨酸3mL,摇匀,于37℃水浴加热15min后取出,测其吸光度A0。然后分别加入一定浓度的待测液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL,然后再分别加入蒸馏水0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL、0mL,摇匀,继续水浴加热15min,取出测其吸光度AX。为消除后加的共1.0mL待测液和蒸馏水所造成的体系吸光度的降低,方法同上,恒温15min后测其吸光度值A00,加1.0mL蒸馏水,摇匀后再测一次其吸光度AXX,A降低=A00-AXX。待测液对羟自由基(·OH)清除率为:·OH清除率(%)=(A0-AX-A降低)/A0×1001.2.4抗氧化活性的测定DPPH·在517nm处强吸收,其乙醇溶液呈深紫色,当有自由基清除剂存在时,由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失,其褪色程度与配对电子数成化学计量关系,因此,可用分光法进行定量分析。抗氧化能力用抑制率来表示,抑制率越大,抗氧化性越强。其公式为:抑制率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100式中:Ai──加抗氧剂时DPPH·溶液的吸光度;Aj──提取液在测定波长时的吸光度;具体操作为:分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL不同体积的各待测液于具塞试管中,加入2mLDPPH·溶液,然后用无水乙醇将体系补至4mL,摇匀,30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度Ai;同时测定2mLDPPH·溶液与2mL无水乙醇混合后吸光度Ac;方法同Ai操作,当加入不同体积待测液后,直接用无水乙醇补至4mL,混合后测体系吸光度Aj。根据公式计算抑制率。1.2.5na2s2o3溶液的制备在模拟胃液条件下测定样品的过氧化氢清除率。取0.1mol/L柠檬酸缓冲液5mL,一定浓度的待测液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于具塞试管中,H2O定容至25mL,加入0.1mol/LH2O2(现配)1mL,置37℃恒温水浴中保持20min,取出,加入10%KI溶液2mL、2mol/LH3P041mL,暗处反应120min,用0.02mol/LNa2S2O3溶液滴定。其原理如下:还原性成分+H2O2(过量)→氧化产物+H2O+H2O2(残留)1.2.6清除苦荞黄酮的制备NO2-在酸性条件下,与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐,此重氮盐与显色剂盐酸萘乙二胺盐发生偶合反应,生成紫红色的偶氮化合物,故可用比色法测定NO2-含量。具体操作为:分别量取不同浓度梯度的苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁、Vc水溶液放于25mL量瓶中,加入5μg/mL的亚硝酸钠溶液1mL然后置于37℃水浴锅中反应30min,各加入0.4%对氨基苯磺酸1mL摇匀静置5min;再加入0.2%盐酸萘乙二胺显色剂0.5mL摇匀加水定容,静置15min后,以蒸馏水作空白测各溶液的吸光度A,把未加NO2-离子清除剂的溶液所测得的吸光度定为A0,即空白值。按以下公式计算待测物对NO2-的清除率。清除率(%)=(A0-A)/A0×100式中:A0──不加待测液时反应体系的吸光度;A──加入待测液时反应体系的吸光度。2结果与分析2.1vc对邻苯三酚自氧化体系中超氧阴离子的清除作用提取物与对照对超氧阴离子(O2-·)清除效果见表1、表2。由表1、表2结果可知,苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁加入反应体系中的量为0.4~2mg范围内时对邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子(O2-·)均有清除作用,而且随着加入量的增加,清除率逐渐增大;Vc在加入量达到0.12mg时就可将体系中的超氧阴离子(O2-·)全部清除。从表1、表2可以看出,各清除剂对超氧阴离子(O2-·)清除效果顺序为Vc>精提物>芦丁>粗提物,经大孔树脂纯化后,等量的精提物对超氧阴离子(O2-·)清除效果优于粗提物。2.2黄酮加入量对苦荞黄酮粗提物、精提物清除率的影响,c提取物与对照对羟自由基(·OH)清除效果见表3。由表3结果可知,苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁及Vc对羟自由基(·OH)均有一定的清除作用,而且在反应体系中加入量为0.4~2mg范围内时,随着加入量的增加,苦荞黄酮粗提物、精提物的清除率表现为先增大然后减小的趋势;芦丁对羟自由基的清除率随着0.4~2mg范围内加入量的增大逐渐减小;而Vc在反应体系中加入量为0.4mg时对羟自由基已有很高的清除率,达到95.68%。同时由试验结果可以看出,经大孔树脂纯化后,等量的提取物对羟自由基(·OH)清除效果有所降低。2.3添加量对dpph自由基抑制率的影响提取物与对照对DPPH·自由基清除效果见表4、表5。由表4、表5结果可知,苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁及Vc对DPPH·自由基均有一定的抑制作用,而且在反应体系中加入量为0.4~2mg范围内时,随着加入量的增加,苦荞黄酮粗提物、精提物及芦丁的抑制率逐渐增大,当抑制率达到50%时,提取物加入量约为1mg。从表5可以看出,1mg提取物相当于加入约0.1mgVc时对DPPH·自由基的抑制率。而且由试验结果发现,经大孔树脂纯化后,等量的提取物对DPPH·自由基清除效果明显增加。2.4苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁及vc对h提取物与对照对H2O2清除效果见图1。由图1可知,苦荞黄酮粗提物、精提物、芦丁及Vc对H2O2均有一定的清除作用,而且苦荞黄酮粗提物经过大孔吸附树脂纯化后对H2O2的清除效果明显提高,约为半量Vc对H2O2的清除效果。2.5苦荞黄酮的清除能力提取物与对照对NO2-清除效果见表6。从表6可以看出,随着反应体系中清除剂加入量在0.4~2mg范围内的逐渐增加,苦荞黄酮粗提物对NO2-的清除率呈现出逐渐减小的趋势,芦丁对NO2-的清除率表现为先增大然后逐渐减小,精提物及Vc对NO2-的清除能力随着反应体系中加入量的逐渐增加呈上升趋势。可以推测,苦荞黄酮粗提物及芦丁对NO2-离子清除能力有一最适浓度,浓度太高或太低清除能力都会减弱,经纯化后,对NO2-离子清除效果明显增强。3苦荞黄酮的纯化本文采用不同的自由基体系对苦荞黄酮提取物的体外抗氧化活性进行了较为全面的研究,从试验结果可以看出,苦荞黄酮对自由基及其NO2-均有不同程度的清除作用,而且经大孔吸附树脂纯化后,提取物的清除作用与粗提物相比没有降