猕猴桃小肠血管活性肠肽的分布及受体的表达

猕猴桃小肠血管活性肠肽的分布及受体的表达

20世纪70年代，sutt从猪的肠道中分离出具有强烈伸展效果的活性物质，即血管活性物质（vip）。VIP是肠神经系统(entericnervoussystem,ENS)中最具有代表性的神经肽之一,广泛分布于全身各个系统,是一种具有多种生物学活性的重要胃肠多肽。免疫组织化学研究表明,VIP分布于整个ENS,存在于许多动物的胃、小肠、大肠的肌间神经丛和黏膜下层神经丛,VIP神经元是ENS中主要的抑制性神经元。小肠在胚胎期是一简单的直管,在发育过程中经历了长度增加、弯曲、肠袢形成、扭转、旋转、盘曲等过程。ENS在出生后发育加速。在发育过程中,作为ENS的重要递质,肠内VIP的含量演变规律并不清楚。VIP对肠道动力、血液供给、水与电解质的分泌、肠黏膜免疫具有重要的调节功能。探讨发育过程中小肠、肝脏VIP的产生经历了怎样的演变过程,有助于理解消化系统的发育、衰老及肿瘤的发生。我们曾在大鼠的实验中观察到,从胚胎到幼年肝脏VIP含量逐渐增加,但成年大鼠肝脏VIP含量却明显下降,VIP受体1型(VIPreceptor1,VIPR1)的含量在出生前后也有类似的变化规律。以往研究认为,肝细胞上VIPR与VIP结合后使VIP迅速降解,因此外周血中VIP含量极低。按此推测,成年肝脏中应有大量VIPR才能满足对出生后增长的VIP降解的需求,但实际检测的情况却并非如此。此外,大鼠与灵长类在种属上有较大差别。本文观察了胚胎、新生和成年猕猴小肠、肝脏VIP及其受体含量及分布的变化。1材料和方法1.1年龄及胎龄及胎龄4只健康猕猴来自成都野生动物世界,检疫均为合格,年龄分别为胚胎6月、新生2d、新生45d及成年,胎龄根据孕猴末次月经推算。研究人员获得四川大学动物实验许可证书。1.2血样的采集和处理给猕猴皮下注射鹿眠宁(二甲苯胺噻唑和盐酸二氢埃托啡经优选配比组成的复方化学保定剂)20～35μL/kg麻醉,股静脉穿刺抽血5mL,无菌手术铺巾,剖开腹腔,抽取门静脉血3mL,分别取回肠末端组织(距回肠末端2～3cm)和肝右叶组织。将所采集的全血(外周血和门静脉血)分别注入含10%EDTA-Na260μL、抑肽酶3000kIU的预冷玻璃管中,混匀后立即2500r/min离心15min,分别取血浆0.5mL/管、1.0mL/管,-20℃保存。组织标本一部分用石蜡包埋、切片,另一部分快速冻存于-80℃。孕猴行剖宫术取出胎猴,处理方法同上。血浆标本准备、小肠及肝脏组织匀浆制备、组织样本蛋白质定量测定等具体操作参考我们已报道的方法。1.3检测结果的计算按VIP放射免疫试剂盒(海军放射免疫技术中心,北京)操作说明进行,放射免疫检测分析仪(SN-695B型,智能放射免疫计数仪,上海核所日环光电仪器有限公司)自动绘制标准曲线并计算和打印检测结果。每个年龄段的回肠、肝脏、门静脉和外周血标本各取3份,每份测2次。1.4抗菌药的制备制作不同发育阶段猕猴小肠和肝脏组织石蜡切片,于60℃烤箱烘烤2h或过夜。脱蜡,微波抗原修复15min和酶消化(37℃)20min,10%正常山羊血清封闭,室温孵育20min。滴加兔抗人多克隆VIP抗体工作液(Zymed公司,美国)。37℃孵育120min后4℃过夜。按链霉卵白素-过氧化氢酶免疫组化试剂盒(Zymed公司,美国)说明书完成免疫染色各步骤,DAB(SantaCruz公司,美国)显色、封片。1.5胃蛋白酶处理制作不同发育阶段猕猴小肠和肝脏组织石蜡切片,脱蜡,20%双氧水灭活内源性过氧化物酶,加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,用含DEPC的1%多聚甲醛浸泡。加预杂交液,盖原位杂交专用盖玻片,37℃恒温箱孵育4h。加杂交液,在37℃用SSC洗涤,加封闭液,依次滴加生物素化鼠抗地高辛及生物素化过氧化酶(博士德生物工程有限公司,武汉),DAB显色、苏木素复染、中性树胶封片。1.6hpv含量测定数据用mean±SD表示。所测组织标本中VIP含量以ng/mg蛋白表示。统计分析采用SPSS10.0统计软件方差分析,P<0.05为有显著性差异。2结果2.1不同年龄的对阶段小鼠组织的hpv含量的影响随着小肠的发育、成熟,小肠内VIP含量逐渐增加,至成年期时达最高水平。而在肝脏组织,VIP含量变化趋势恰好与小肠相反。在猕猴胚胎期,小肠组织的VIP含量仅较肝脏组织高约36%。但出生以后,小肠组织的VIP含量急剧增加,在新生2d时,小肠组织的VIP为肝脏的16倍。进入成年,肝组织中VIP含量显著降低,仅为胚胎期的30%(P<0.01);但小肠组织中VIP较胚胎期升高25倍(P<0.01);小肠组织VIP含量远高于肝组织,约为其115倍(P<0.01)(表1)。不同年龄猕猴门静脉的VIP含量均高于外周血水平。值得注意的是,成年期猕猴门静脉VIP含量较外周血高出18倍(P<0.01),其差值远高于胚胎和新生期(表1)。2.2仅有规律分布的阳性点,可能引起重或轻、轻胚胎6月时,在猕猴小肠绒毛根部及黏膜下层可见少量的VIP阳性染色颗粒,新生2d时这些变化不大,但新生45d时随着小肠绒毛的增加,黏膜下层VIP阳性染色颗粒增加,可见增大的、不规则的、VIP阳性染色极为浓集的结构,绒毛隐窝部的VIP阳性染色颗粒也增加,在环行肌层可见少量散在的阳性VIP染色颗粒。当发育进入成年,黏膜下层神经可见极为浓集的明显的VIP阳性染色,小肠绒毛隐窝部的VIP染色明显增加,呈浓集的星状颗粒样分布。在环、纵行肌间神经丛及环行肌,也可见到散在的或聚集成环状的VIP颗粒(图1)。胚胎6月和新生2d,猕猴肝脏内可见散在无规律分布的阳性VIP染色颗粒。新生45d后至成年,肝脏内难以见到阳性VIP染色(图2)。2.3其他相关的传统hpvr1表达从胚胎到成年小肠VIPR1的表达逐渐上调。在成年小肠VIPR1主要分布于绒毛隐窝部、黏膜下层神经及环、纵行肌间神经丛及环行肌。在胚胎及新生期,环、纵行肌尚未充分发育,难以见到VIPR1表达。进入成年,环、纵行肌间神经丛及环行肌可见大量VIPR1表达,聚集成环状(图3)。胚胎6月,猕猴肝脏血管可见阳性VIPR1染色。出生以后至成年,肝脏血管VIPR1染色逐渐转阴性(图2)。3期肝脏正常生长和非胆碱能、no活动中肝脏考虑的其他因素VIP是ENS的重要抑制性递质。以往的研究认为,在人的回肠,VIP主要分布于黏膜下层和环形肌层,这些数据仅来自小肠分离的各部分检测,缺乏整体形态学研究,更没有从发育的角度认识ENS。本实验首次观察到,从胚胎到成年,猕猴小肠壁内的VIP最初来自黏膜下层的神经,当此处VIP神经纤维由细增粗时,VIP神经纤维网络逐渐扩展至肠黏膜隐窝部,环、纵形肌间神经丛及环行肌。从形态学观察到放射免疫定量分析,小肠内VIP含量随着发育的成熟大量增加,反映了ENS是在出生以后才得以迅速发育的。以往一直认为,释放入黏膜或肌层内的VIP进入门静脉血循环后主要是在肝脏与肝细胞上的VIPR结合而被降解、灭活。所以,血浆VIP水平很低。本实验中,在胚胎6月,猕猴肝细胞没有表达VIPR1,此时小肠VIP含量仅较肝脏高约36%,门静脉和外周血VIP含量也无显著差别,提示此阶段小肠VIP并不经肝脏代谢。出生后到成年,肝细胞上仍未见VIPR1表达,但成年小肠VIP含量为肝脏的115倍,可以认为来自小肠的VIP进入门静脉后,很快被血循环中的中性内肽酶降解,VIP并不在肝脏被降解和代谢。胚胎6月,猕猴肝脏血管可见阳性VIPR1染色,由于VIPR在胚胎血管发生中起着重要作用,因此胚胎期猕猴肝脏血管的VIPR1与肝血管床的发育密切相关。出生以后至成年,肝脏血管VIPR1染色逐渐转阴性,肝脏的体积也渐趋稳定。VIPR在干细胞分化为上皮细胞的早期即可出现,此外,肠上皮的VIPR也存在于因基因表达程序不同而导致的不同细胞表型中,如肠细胞和分泌黏液的杯状细胞,这与VIP对不同分化表型细胞株的水电解质和黏液分泌中的双重调节作用相一致。肠细胞富含VIPR,目前认为VIP对肠细胞可能有直接作用。在胚胎和新生期,仅在小肠绒毛上皮层有少量的VIP,黏膜隐窝处未见VIP分布。而此时小肠上皮普遍表达VIPR1,因此VIPR1可促进小肠上皮细胞生长。最近研究表明,VIP也有促生长作用,可促进胚胎结、直肠的发育。但是在这一发育阶段,由于VIP的含量并不高,更因为没有食物的刺激,小肠绒毛发育比较慢。VIP能促进水与电解质的分泌,主要是通过肠绒毛上皮顶端的Cl-门控通道刺激Cl-分泌,对侧基底膜的K+,Na+/Cl-共转运也有促进作用。我们观察到,从胚胎到成年小肠VIPR1的表达逐渐上调,在成年小肠主要分布于绒毛隐窝部、黏膜下层神经及环、纵行肌间神经丛及环行肌。在成年肠黏膜上皮内VIPR1分布较多,同时伴有小肠绒毛发育的成熟。VIP阳性神经元主要位于小肠绒毛的隐窝部,而VIPR1则散在分布于整个小肠绒毛,说明从VIP阳性神经元释放出的VIP并不仅在一个很小的局部范围内发挥作用,它至少可从绒毛的隐窝部弥散到绒毛的顶端。VIP和NO是非胆碱能、非肾上腺能神经递质,VIP对消化道运动起抑制性调节作用,其调节途径有NO相关性和NO非相关性(即cAMP依赖的蛋白激酶途径)两种。VIP作用于胃肠道平滑肌细胞表面的特异性受体,通过结合Gs蛋白激酶激活腺苷环化酶,使细胞内cA