知母总酚的降血糖活性研究

知母总酚的降血糖活性研究

知母是百合科植物知母（aa）的干燥根茎。它是中国传统的中药，具有清热、清火、润津、干燥等功效。知母有悠久的降血糖应用历史,《神农本草经》中已有知母可用于消渴症治疗的记载。现代研究也表明知母有较好的降血糖作用。知母水提物口服和腹腔注射均有明确的降低高血糖模型小鼠血糖的作用,有研究表明知母水提物口服降血糖活性成分是芒果苷及其糖苷,其机制可能是降低胰岛素抵抗,也有研究表明是多糖起到降血糖作用。还有研究表明知母皂苷也具有降血糖活性。目前知母降血糖机制和活性部位及成分还不是很清晰。为此,本文对知母进行了提取、分离和纯化,并对各组分进行了降血糖作用的实验研究,现将结果报告如下。1试剂、仪器和仪器知母,购自安徽亳州药材市场,并经南京中医药大学生药教研室吴启南副教授鉴定。4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),Merck公司;α-D-葡萄糖苷酶(α-D-Glucosidase,EC3.2.1.2G),Fluka公司;阿卡波糖(Acarbose,商品名:拜堂平),浙江东立公司;四氧嘧啶(Alloxan)、链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司,临用前用柠檬酸缓冲液配成浓度为1%的STZ溶液;血糖测定试剂盒,卫生部上海生物制品研究所,批号:20039218;肾上腺素,上海天丰药厂,批号:021224;消渴丸,广州中药一厂,批号:20030316;GF254,青岛海洋化工厂;LSA-10大孔吸附树脂,西安蓝深交换吸附材料有限责任公司;其余所用化学试剂均为市售分析纯。WRS-18型显微熔点测定仪,上海科学仪器厂;IR-5DXFT型红外光谱仪、FIMS-2000型质谱仪,美国Necolet公司;SIMADEZUUV-1240型紫外扫描仪,日本岛津公司。ICR小鼠、SD大鼠,雄性,中国药科大学实验动物中心,合格证号:SCXK(苏)2002-0011号。2方法和结果2.1水质、流份和仪器知母用10倍量水煎煮2次,每次1h,放冷,过滤,浓缩至1g/ml,加乙醇醇沉至含醇70%,得沉淀粗多糖,再用sevag法脱去杂蛋白质,即得知母总多糖(polysaccharidesofanemarrhenaasphodeloides,PAA)。PAA以葡萄糖为对照,苯酚-硫酸比色法测定总糖含量为79%。知母用10倍量水煎煮2次,每次1h,放冷,过滤,浓缩至1g/ml,加乙醇醇沉至含醇70%,过滤,乙醇液回收尽乙醇,得流浸膏,再加水稀释至0.5g/ml、调pH值为3,正丁醇1/3体积萃取3次,得正丁醇层调pH值为7,以水1/3体积萃取3次,得水层调pH值为3,正丁醇1/3体积萃取3次,回收正丁醇,得知母总酚(totalpolyphenolofanemarrhenaasphodeloides,TPAA)。TPAA以芒果苷为对照,酒石酸亚铁反应比色法测定总酚含量为80%。知母用10倍量60%乙醇回流2次,每次1h,放冷,过滤,乙醇液回收尽乙醇得浸膏,浸膏加水溶解至0.2g/ml,过滤,滤液调pH值为8,过LSA-10大孔吸附树脂,水洗、碱洗至无色,80%乙醇洗脱,滤过,回收乙醇,得知母总皂苷(totalsaponinofanemarrhenaasphodeloides,TSAA)。TSAA以拔契皂苷为对照,紫外分光光度法测定TSAA含量为87%。TPAA10g拌柱色谱硅胶后经硅胶(300g)柱色谱,以乙酸乙酯-MeOH进行梯度洗脱(500∶0→0∶250),共收集100个流份,每个流份500ml。以硅胶GF254板作TLC检查,先在紫外下254nm检查暗斑,再以碘显色。合并斑点相同成分(Fr1-15,Fr16-57,Fr58-76,Fr77-139,Fr140-187),Fr16-57析出白色针晶,重结晶得到化合物Ⅰ约10mg,Fr77-139析出黄色针晶,50%甲醇重结晶得到化合物Ⅱ约30mg,Fr140-187析出黄色针晶,50%甲醇重结晶得到化合物Ⅲ约20mg。2.2内标化合物为芒果苷化合物Ⅰ无色针晶,mp198～201℃,Liebermann反应呈阳性,与拔契皂苷元对照品薄层性质一致,故鉴定化合物Ⅰ为拔契皂苷元。化合物Ⅱ淡黄色针晶,三氯化铁显色呈阳性。mp257～258℃,EI-MSm/z(%):M-1583;UvλMeoHmaxmaxΜeoΗ(nm):254.0,270,325,373,TLC与芒果苷对照品薄层性质一致,故鉴定化合物Ⅱ为芒果苷。化合物Ⅲ黄色粉末,三氯化铁显色呈阳性。mp256～258℃,EI-MSm/z(%):M-1763,UvλMeOHmaxmaxΜeΟΗ(nm):241,258,316,365;IR(KBr)υmaxcm-1:3360,2925,1645,1615,1475,1370,1300,1190,1080,1040,1020。以上数据与文献报道一致,故鉴定化合物Ⅲ为新芒果苷。2.3抗高血压活动的筛选2.3.1对小鼠血糖的影响取健康雄性小鼠70只,除10只作为正常对照组外,其余小鼠均腹腔注射100mg/kgSTZ,72h后眼底静脉取血以葡萄糖氧化酶法测定血糖,取血糖值≥11.1mmol/L者为糖尿病小鼠。随机分为5组(给药组以临床生药用量1g/kg折算),即:糖尿病模型组(DM),PAA组(300mg/kg),TPAA组(200mg/kg),TSAA组(250mg/kg),消渴丸组(1500mg/kg)。每天灌胃1次,连续10d,正常对照组及模型对照组灌胃给予等量生理盐水。末次给药后动物禁食10h,眼底静脉采血,用葡萄糖氧化酶法测定小鼠血糖,结果见表1。结果显示,TPAA和消渴丸具有显著的降低糖尿病模型小鼠血糖的作用,而同等生药量的PAA和TSAA未显示该作用,虽有降低趋势,但与模型组相比,无统计学意义。提示TPAA为知母降血糖的主要有效组分。2.3.2tpaa的抗高血压作用2.3.2.tpaa对高血压小鼠血糖的影响取健康雄性小鼠125只,除16只留作正常对照组外,其余109只小鼠禁食12h后,尾静脉注射四氧嘧啶100mg/kg。72h后禁食8h,测定空腹血糖,选择血糖值≥11.1mmol/L的小鼠供试验用,根据血糖值将高血糖小鼠分为5组,分别为DM组,消渴丸组,TPAA低、中、高剂量组,按表2中剂量给药,1次/d,连续给药3周,监测血糖值,结果见表2。表2表明,TPAA高剂量和消渴丸均能明显降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖。2.3.2.tpaa对大鼠血糖的影响取健康雄性SD大鼠90只,随机选取10只作为正常对照组,其余80只造模。动物禁食不禁水12h,按65mg/kg体重的剂量腹腔注射STZ,正常对照组按相同剂量注射柠檬酸缓冲液,于造模后1周测定各鼠空腹血糖值,筛选血糖值超过11.1mmol/L的大鼠为糖尿病实验模型鼠。将55只糖尿病实验模型成功大鼠按血糖值分为DM组,消渴丸组(灌胃消渴丸1500mg/kg),TPAA低、中、高剂量组(分别为40,80,160mg/kg),正常对照组和DM组灌等量水,连续给药4周。末次给药后禁食12h,眼眶静脉丛取血,分离血清测血糖变化值,结果见表3。由表3可见,治疗组血糖值均有一定的降低,TPAA高剂量组统计有显著意义。2.3.2.tpaa抑制-葡萄糖苷酶活性的测定TPAA和拔契皂苷元、芒果苷、新芒果苷均溶于DMSO,阿卡波糖溶于DMSO缓冲液,并稀释为不同浓度药液(DMSO终浓度均小于0.6%,且在此浓度下DMSO对酶的活力没有影响),与2U/ml葡萄糖苷酶10μl混匀,于37℃温育15min,加入10mmol/LPNPG90μl,37℃继续温育15min,在410nm波长下测定A值,以上反应在96孔板上完成,反应总体积为200μl。每个供试品同时做3复孔,取平均值,并重复3次实验。阿卡波糖作为本法的阳性对照,同时设定空白对照和阴性对照。计算酶活性的抑制率:抑制率=(A阴性对照-A供试品)/(A阴性对照-A空白对照)×100%。为消除TPAA药物本身的颜色干扰,测定时每个供试品均设背景吸收,并对最终测定结果进行校正。结果见图1,2。结果显示,TPAA对α-葡萄糖苷酶有较明显的抑制活性。由于α-葡萄糖苷酶在糖尿病的发病过程中起着重要作用,TPAA对α-葡萄糖苷酶的抑制活性可能与其抗糖尿病活性有关。芒果苷对α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制效果,但作用稍弱于TPAA,而新芒果苷则对酶活性无影响。3中医治疗糖尿病的知母作用糖尿病的发病率最近几年呈现持续上升趋势,糖尿病的预防和治疗已成为目前医药界的一个重要课题,糖尿病中医属于消渴病的范畴,中医治疗原则主要集中在:滋阴降火润燥,益气养阴,生津止渴,活血化瘀,升阳布津等几方面。知母为中医临床治疗糖尿病的一味传统中药。根据统计全国多种医药杂志,并结合我国古代医