第二章动物细胞培养第一节动物细胞培养概述第二节动物细胞培养

第二章动物细胞培养第一节动物细胞培养概述第二节动物细胞培养基本技术1Cellengineering第一节动物细胞培养概述一、细胞体外生长的类型

二、细胞体外培养特点三、组织细胞培养的优点四、组织细胞培养的缺点五、细胞培养的工作方法2Cellengineering一、细胞体外生长的类型分为贴附型与悬浮型两种：

大多数细胞的体外生长方式采用贴附型。

瘤细胞、淋巴细胞等采用悬浮型生长方式。左031215-031124h25-1204（3）-1发现一种细胞切断式起始生长

生长极为迅速x50

右对照3Cellengineering贴附型细胞也称锚着依存性细胞。动物细胞在体外生长的环境不同，其贴附方式也不同。大致分为以下四种：①成纤维细胞型②上皮细胞型③游走细胞型④多形型细胞4Cellengineering①成纤维细胞型

此类型的细胞外形与体内成纤维细胞形状类似。细胞培养后形成梭形或不规则三角形，细胞核圆形位于中央，有较大的细胞间隙；细胞质向外伸出2~3个长短不同的突起，细胞群常连接成网状、放射状等各种状态，生长时呈放射状、漩涡状走向。5Cellengineering②上皮细胞型

体外生长的细胞形状上类似于上皮细胞。细胞贴壁后为扁平的不规则多角形，中央有扁圆形核，生长时彼此紧密联结成单层细胞。起源于内胚层和外胚层的细胞在体外培养时可能呈现上皮型，如皮肤表皮、血管内皮细胞等。6Cellengineering生长特点：

易相连成片，紧密相连成薄层--铺路石状生长，呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

体外培养细胞类型（1）——上皮细胞型7Cellengineering③游走细胞型细胞在支持物上分散生长，从胞质伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且运动方向不规则，在培养器皿上位置不固定，一般不连接成片。④多形型细胞体外培养时形态不规则，一般分为胞体和胞突两部分，其中胞突为细长形，类似于丝状伪足。如神经细胞。8Cellengineering多形型细胞9Cellengineering实际上，体外培养的细胞并不一定呈现某一种典型的形态，而呈现的是一些过渡形态。受到生长环境的影响。随培养基的营养成分、血清成分、温度、pH、气相环境等发生改变。因此，细胞形态特征只是一种参考性指标。Hela癌细胞，是1951年从一位美国黑人妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成的细胞系。在过酸或过碱的环境中变成梭形，在酸碱适中时又恢复上皮细胞特征。10Cellengineering非贴附型细胞（悬浮型）

细胞悬浮生长，生存空间大，能够大量繁殖细胞，传代方便(只须稀释而不须消化处理)，易于收获细胞的优点，易于操作控制，易于大规模生长，但不易观察。细胞常呈球形游动，如血液中的淋巴细胞、白细胞以及某些肿瘤细胞、胚胎细胞属于悬浮型细胞。适于进行血液病的研究。

11Cellengineering二、细胞体外培养特点1.繁殖代数有限：与端粒结构有关。2.贴壁依赖性：细胞需在贴附物上逐渐伸展生长，形成一定的形态。一些特殊的物质可能参加促进细胞附着的过程。3.密度抑制：因营养物质的枯竭、代谢产物堆积发生生长抑制现象。12Cellengineering4.接触抑制：一般正常的细胞不停活动或移动。当细胞培养数量增多，细胞间相互接触使细胞停止运动和生长。这种现象称为接触抑制。一般密度抑制和接触抑制是同时发生的。

肿瘤细胞无接触抑制，因此，肿瘤细胞能堆积，是区别正常与癌细胞的标志。5.呈现去分化状态：从机体内取出的细胞具有不同分化状态，培养时表现去分化，以至分不出细胞

最初的来源。13Cellengineering三、组织细胞培养的优点1.研究对象是活细胞。

可长期地监控、检测、甚至定量评估各种指标------是其它方法无法达到的。2.可人为控制培养环境。

包括温度、湿度、pH、氧气、二氧化碳含量等物理化学的条件，培养液的基本营养成分、某些特定成分及细胞因子对细胞生长和功能的影响。3.研究的样本基本均一。

经过培养一定代数，可得到基本均一的细胞。14Cellengineering4.便于观察、检测和记录。

采用倒置相差显微镜、电视、电影等直观手段来观察、检测和记录细胞变化。电镜分析细胞超微结构；同位素标记、放射免疫等检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。5.研究的范围比较广泛。

细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等均可利用细胞培养进行研究。6.研究的费用相对比较经济。

相对动物体内试验经济且易于观察。7.筛选有一定特征变异的突变株或细胞融合体。

有利于进行基因功能的研究。15Cellengineering四、细胞培养的缺点1.最根本的问题----细胞在体外培养的形态和功能会发生一定程度的改变，不完全等同于体内。2.遗传不稳定----体外反复传代、长期培养的细胞易发生染色体变异。3.对营养的要求较高----往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素和生长因子等，需要用血清、胚胎浸出液来提供。来源比较稀少、昂贵、成分不确定，目前正在研究无血清培养液来调控细胞生长。16Cellengineering4.对实验条件要求较高。

影响细胞培养技术的推广应用。5.培养中的污染问题。

动物的细菌、真菌、病毒疾病污染细胞；操作过程中任何的细小问题都可能引起污染。

显著污染的标志是培养基pH值迅速改变，外形模糊，甚至出现漂浮的细胞及其碎片。17Cellengineering五、细胞培养的工作方法认真、仔细、动脑1.标准化的工作方法。2.严格按操作要求配制各种液体。3.标明名称、浓度、制备日期和配制人等信息。3.一切培养用品都要有固定的存放点，尤其重要的是：培养用品与非培养用品严格分开，消毒区和污染区严格分开。18Cellengineering第二节动物细胞的培养基本技术一、动物细胞培养的基本过程1.材料选择

2.材料处理

3.细胞培养和建系4.建立细胞株（系）二、细胞的常规检查1.生长状态

2.形态和活力测定

3.生长曲线的测定

4.营养状况的观察

5.污染状况的观察19Cellengineering

1.材料选择

原则上各种动物组织都可以进行体外培养。

实际上幼体组织比老龄组织更容易培养成功，尤其是胚胎组织，分化程度低、增生能力强。肿瘤组织比正常组织容易培养。

取材前要对动物组织进行详细检查记录。一、动物细胞培养的基本过程20Cellengineering1)要注意新鲜和保鲜

新鲜的活组织易于培养成功！取材后，应尽量在4~6h内能制作成细胞培养；若不能及时培养，应于4℃存放。也可加入含10％二甲基亚矾的培养基，冻存于液氮中。2)应严格无菌

所用的所有器皿要严格灭菌！取材也必须在无菌环境下操作。可在高浓度抗生素培养液内，4℃下存放1-2h。应避免接触有毒、有害的化学物质，如碘、汞等。21Cellengineering3)防止细胞机械损伤取材时要用锋利的器械，尽量减少对细胞的损伤。4)避免组织干燥取材、切碎，整个操作时避免组织干燥，在含少量培养液的器皿中进行。22Cellengineering2.材料处理

用适当的生物化学方法将剪碎的组织块分散成细胞或细胞团。包括材料的清洗、修剪和消化的过程。1)（组织）细胞的分离悬浮细胞分离:来自羊水、血液、胸腹水等体液的细胞，经800～1000r/min离心5~10min（可加入淋巴细胞分离液、Ficoll、Percoll等），弃上清液，存留细胞。多次反复，获得洁净细胞。

注：速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或

机械损伤细胞。23Cellengineering实体组织细胞分离

麻醉（杀死）动物─→无菌切取组织块─→放入灭菌的PBS液中（必要时加入抗菌素）浸泡、封住瓶口─→带入层流室─→冲洗血污3~5遍─→修剪、切除多余部分（筋腱、脂肪、血管等）─→切取进行细胞培养的部位─→剪碎组织成小块（0.5～1mm3）。24Cellengineering2）细胞悬液制备

机械分散法：对脑组织、部分胚胎组织，采用剪刀剪碎、吸管（或9号注射针）吹打的方法，充分分离细胞。此法相对简便、快速，但对组织机械损伤大。仅适于纤维成分少的软组织。消化分离法：把剪成小块(或糊状)的组织，应用酶的生化解离作用，使细胞间的连接松动、膨松，再采用机械法吹打、分散，使细胞团块得以充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，此种方式形成的细胞容易贴壁生长。25Cellengineering具体步骤

将充分剪碎的细小组织块─→加入5~10倍体积比的消化酶，37℃酶解10~20分钟─→不时观察细胞间隙的变化─→细胞间疏松后，加入10倍于消化液的含钙的培养液中止消化─→4层纱布或100目不锈钢网过滤除去残余组织块─→800～1000r/min离心3~5min，弃上清液，加培养液，吹打悬浮细胞─→再离心，反复2～3次，彻底清除消化液─→最后一次离心后，加培养液悬浮细胞后，计数─→按一定浓度接种到培养皿培养。26Cellengineering细胞计数

计数方法与微生物细胞的计数方法类似。通常以“细胞个数/mL”来表示。注意1.若细胞团数超过10%，则消化不充分；若细胞数少于20个/mm3或多于50个/mm3，说明稀释不当，都要重新操作。一般每个大方格中细胞数量以20~50个为宜。2.细胞密度低于104，则无法计数。3.细胞悬液密度计算公式：

（个/ml）=四个计数室细胞之和/4×10427Cellengineering3.细胞培养和建系28Cellengineering①消化培养法

将消化后的细胞接种到培养皿中，5%CO2、37℃条件培养。

一般原代培养，细胞生长较慢，最好前2天减少移动和观察的次数。3~5天左右，观察细胞贴壁和生长状况，根据情况换液，此时培养液最好不要有大的调整，维持培养至细胞基本接近融合（75%~80%）时，开始传代。29Cellengineering②悬浮培养法

1907年由Harrison最早创立。在盖玻片滴上用培养液稀释到一定浓度的细胞悬液，翻转盖玻片，使组织块及营养液悬挂于培养液表面张力所形成的水滴中，细胞可向四周迁移生长、单独或聚集生长。

缺点

细胞生长空间狭小，营养不足，细胞不能持续、长时间生长。30Cellengineering31Cellengineering③细胞的传代培养

吸去细胞培养液（或再用PBS冲洗一次）─→加入0.25%的胰蛋白酶，以覆盖细胞为宜─→37℃消化3~5分钟，不时观察细胞─→发现胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大，加入含血清的培养液或含钙离子的Hanks液终止消化─→轻轻吹打细胞，至所有细胞脱离皿底─→吸取细胞悬液到离心管中，500~1000转/分钟离心5分钟─→弃去上清液，用培养液再次悬浮细胞，离心清洗一次去除消化液─→弃去上清液，用培养液悬浮细胞，计数（一般105～106个/ml）接种。32Cellengineering每次传代后细胞的生长过程

实际是指细胞在每次传代后，对外界环境的适应和生长恢复的过程。33Cellengineering体外培养细胞的生长曲线潜伏期34Cellengineering潜伏期（LatentPhase）

包括悬浮期及潜伏期。

当细胞接种后，细胞的胞质先回缩，胞体呈圆球形。进入新的培养器皿后先悬浮，短时间后，开始附着于底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。

再经过一段时间，细胞恢复代谢及运动后，才出现细胞分裂并逐渐增多。一般细胞潜伏期约为24~96小时。肿瘤细胞及连续（生长）细胞系，则更短，可少于24小时。35Cellengineering指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）

又称对数期。细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。

只要有理想的培养条件，细胞将不断生长繁殖，数量日渐增加。逐渐接触连成一片，长满培养器皿底面。此期的时间长短因细胞特性及培养条件而不同，一般可持续3~5天。

36Cellengineering停止期（StagnatePhase）

又称平台期，当细胞生长区域逐渐减少甚至消失。因接触抑制细胞运动停止、密度抑制细胞终止分裂。

细胞尚有活力，但已不再分裂增殖。若及时分离培养、进行传代，细胞将在新的培养器皿继续生长，再次繁殖。否则，细胞因代谢中毒而发生改变，甚至脱落、死亡。

37Cellengineering④细胞的纯化

一般分自然纯化和人工纯化两种。自然纯化

在长期传代生长中，利用细胞的增殖优势，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然淘汰法，留下生长旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。缺点

无法按需要选择细胞；花费时间长，多数是成纤维细胞；仅有恶变肿瘤细胞或突变细胞可保留下来。38Cellengineering人工纯化①依赖细胞因子纯化----如加入IL-2形成依赖IL-2的T细胞系。②酶消化法----常用。胰蛋白酶消化时，成纤维细胞先脱壁、上皮细胞后脱壁，采用多次差别消化将上皮细胞和成纤维细胞分开。③反复贴壁法----常用。成纤维细胞贴壁快(10-20min)，上皮细胞慢（1h以上），反复贴壁分离、纯化细胞。39Cellengineering④机械刮除法----采用机械刮取需要的细胞克隆片，或除掉不需要的细胞片，再进行传代培养。⑤细胞克隆法----将细胞稀释到几个或单个细胞，使之生长；或预置小盖玻片或用金属套环，来获取部分克隆细胞。⑥流式细胞仪分离法----根据细胞核酸、细胞表面标识或细胞结构、大小等差别，利用流式细胞仪来筛选。40Cellengineering⑤细胞的冷冻和复苏

常用5～20％甘油或5～12.5％二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂，帮助细胞渡过冰晶期。在-70℃~-90℃保存半年以上，-196℃长期保存。操作方法①将生长良好的细胞按传代方法消化，离心制成细胞压积后，用10%DMSO+20%血清+培养液，现配冷冻液0.6~0.8mL将细胞稀释制成细胞悬液，做好标记。②缓慢降温：大约每分钟1～3℃，至-20℃。与冰块放在一起，在4℃中10分钟，再放入-20℃20分钟。③快速降温：每分钟15～30℃至-196℃。将细胞直接投入液氮罐中，长期保存。41Cellengineering细胞的复苏

一般采用快速融化法。从液氮罐-196℃温度下迅速取出细胞冷冻管，放到37℃水浴中，轻轻摇动试管，使内容物在20～60s内完全溶解，将冷冻细胞液吸出加入到20倍于冷冻液的培养液中，离心1~3次，去除冷冻液，制成细胞悬液，按一定的密度进行培养。42Cellengineering4.建立细胞株（系）a.建立细胞系（株）

实际是指细胞传代再培养的过程，也就是建立细胞系的过程。正常培养的细胞系有两种：有限细胞系和无限细胞系。一般确立的是无限细胞系。43Cellengineeringb.细胞系

原代培养物经首次传代成功或多次传代成功后所得培养物。前期细胞类型多种多样，后期的传代不仅使细胞继续生长，而且逐步演变为类型均匀、特征均一的细胞。经过20次传代，细胞逐渐死亡称为（有）限定细胞系；细胞持续培养和生长为连续细胞系（无限细胞系）。c．细胞株

通过选择或克隆形成具有特殊性质或标志的培养物。在细胞系的基础上，挑选单一细胞进行克隆，形成具有特殊性质、组成单一的细胞株，称为克隆细胞株。从变异的细胞系中筛选细胞株成功率比较高。44Cellengineering二、细胞的常规检查

细胞培养后，要2~3天对细胞做常规检查，主要有：细胞的生长状态、pH、是否污染、活力等情况，随时掌握细胞的动态变化及时处理有关异常情况。1.细胞的生长

主要四个时期：游离期、吸附期、繁殖期、

退化期。45Cellengineering2.细胞的形态观察和活力测定形态生长良好的细胞，镜下观察：透明、轮廓清楚；若生长不好，则细胞折光性不匀，细胞间隙加大，形态不规则等。46Cellengineering活力测定台盼蓝染色法

细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止这类染料进入细胞内。借此可以鉴别死细胞与活细胞。常用的这类染料有台盼蓝、伊红Y和苯胺黑等。

取9滴一定浓度的细胞悬液，加入1滴0.4％台盼蓝溶液，混匀。3分钟内计数活（死）细胞数（死细胞染成淡蓝色，活细胞无色）。计算以活细胞数百分比。47CellengineeringMTT比色法

是一种检测细胞存活和生长的方法。显色剂四唑盐商品名是噻唑蓝，简称为MTT。

该方法被广泛用于一些生物活性因子的活性检测，大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。特点是灵敏度高，重复性好，操作简便、经济、快速、易自动化，无放射性污染，与其他检测细胞活力的方法(如细胞计数法、台盼蓝染色法等)有良好的相关性。48CellengineeringMTT法实验原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，因此，溶液的颜色深浅可间接反映活细胞数量。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，代表活细胞数量的多少。49Cellengineering50Cellengineering操作过程1.接种细胞：传代消化细胞以（103~104）浓度接种于96孔板，每孔200μL。2.培养细胞：37℃、5％CO2、饱和湿度下培养3～5天。3.呈色：第3～5天后，每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20μL，37℃继续培养4h，终止培养。弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。4.比色：设不加细胞只加培养液的空白对照调零。490nm波长测定各孔光吸收值，记录。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。51Cellengine