高考生物二轮复习突破：命题点3 基因工程

命题点3基因工程

II主干整合

i.基因工程的理论基础

(1)不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础

①DNA的基本组成单位都是4种脱氧核昔酸。

②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。

③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。

(2)外源基因可以在受体细胞内表达的理论基础

①基因是控制生物性状的独立遗传单位。

②遗传信息的传递都遵循中心法则。

③生物界共用一套遗传密码。

2.基因工程的三种基本工具

识别双链DNA分子的特定核甘酸序

警列，并使每一条链中特定部位的磷酸

।限制性内二酯键断开

一切核酸酶逊一般用相同限制酶切割载体和目的

基

因方法基因

工

程DNA

的连接醐1①E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端

三(注)1②T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端

种

基

本①能在细胞中进行自我复制，或整合到

工一受体上，随受体同步复制

具DNADNA

一察露一②有一个至多个限制酶切割位点

(特点)

一③具有特殊的标记基因，便于重组DNA分

子的筛选

3.基因工程的基本操作程序

(1)基因工程的四个主要操作步骤

广筛选方法：从相关的已知结构和功能

目的基因的清晰的基因中进行筛选

筛选与获取

一获取方法：常用PCR特异性地快速

扩增目的基因

［位置：基因的上游，紧挨

转录的起始位点

启

(基

核动功能:RNA聚合酶识别和结

因

心子

表合的部位，驱动基因的转录

步

达组表达载体

骤目的基因:人们所需要的基因

)载

体1，，位置：目的基因的下游

的孰功能:终止转录

构

建标记基因：用于目的基因的检

测与筛选

「植物：农杆菌转化法、花粉管通道法

将目的基因导

一动物：显微注射技术（导人受精卵）

入受体细胞

一微生物：Ca?+处理法

「分子水平：PCR等技术、抗原一抗体

目的基因的

杂交

检测与鉴定.

一个体生物学水平：抗性、耐性实验

（2）基因工程操作程序中的注意点

①目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应

插入在启动子与终止子之间。当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要利用特定的启动子,

如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。

②基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止

子位于目的基因的尾端，使转录在所需要的地方停止，而起始密码子和终止密码子在mRNA

上。

③植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此植物基因工程的受

体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；高度分化的动物细胞的全能性受到限制，动物基因工

程中的受体细胞一般是受精卵。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素等则需要用真核生物，

如酵母菌（需要内质网、高尔基体的加工、分泌）等。

4.蛋白质工程

预期蛋白质的功能

设计预庙的蛋白质结构

改造或合成操作

蛋

基因推测应片的氨基酸序列

手段白

设计

改造现有蛋质找到并改变相对应的脱

流程

白质，或制工氧核甘酸序列（基因）或

结果

造出新的蛋程合成新的基因

获得所■要的蛋白质

白质

5.PCR技术原理与条件

人,聚合酶链式反应的缩写，是一种在体

亘工外对目的基因的核甘酸序列进行大量

复制的技术

原理DNA半保留复制

生”模板DNA、2种引物、4种脱氧核昔

条件

3-酸、耐高温的DNA聚合酶（TagDNA

技

PC2R术聚合酶）

理

原勺啰_DNA的合成方向总是从子链的5,端向

条

与方向3,端延伸

件

是一小段能与DNA母链的一段碱基序

引物列互补配对的短单链核酸，使DNA

聚合酶能从引物的3,端开始连接脱

氧核甘酸

□我短时间内大量扩增目的基因

6.PCR技术的过程

变性：加热超过90℃,DNA解链

复性：冷却至50℃左右，引物与互补DNA链结合

延伸：加热到72℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成子链

（l）PCR技术中，不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶。

（2）关于引物：依据目的基因两端的部分核甘酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不

能发生碱基互补配对。有时候引物5,端需要含有某种限制酶的识别序列。

7.DNA的粗提取与鉴定

利用DNA、RNA,蛋白质和脂质

原理等在物理和化学性质方面的差异，

提取DNA,去除其他成分

DNA不溶于酒精，但某些蛋白质

DNA性质溶于酒精;DNA能溶于2moi

DNA的

的NaCl溶液

粗提取

与鉴定.在一定温度下，DNA遇二苯胺试

剂会呈现蓝色

研磨~过滤（取上清液）f加入体积

相等的、预冷的酒精（体积分数为

.95%）,静置2~3min一搅拌（或离

心）~取白色丝状物（或沉淀物）一

溶解一鉴定DNA

8.DNA片段的电泳鉴定

原理在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶

的浓度、DNA分子的大小和构象等有关

DNA片|

鉴星凝胶中的DNA分子通过染色，可以在

段的电

泳鉴定|波长为30（）nm的紫外灯下被检测出来

他篁要避免外源DNA等因素的污染

II真题研究

1.（2023・广东，11）“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解一分离一沉淀一鉴定。

下列叙述错误的是（）

A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质

B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等

C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度

D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色

答案D

解析裂解是使细胞破裂释放出DNA等物质，针对不同的实验材料，可选择不同的方法破

坏细胞，如植物细胞可选择研磨的方法，而动物细胞可选择吸水涨破的方法，A正确；将DNA

溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，溶液能呈现蓝色，D错误。

2.（2023・广东，20）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2〃=10）进行诱

变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型。A/基因发生一个碱基

G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。

回答下列问题：

（1）拟采用农杆菌转化法将野生型ZM/基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，

则转基因植株的种子大小应与_______植株的种子大小相近。

⑵用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和进行切割，用

DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备

（3）转化后，T—DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入，也可

以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点

插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型

的关系。

叵］农杆菌（T-DNA携带D4/基因和卡那霉素抗性基因）

/花序浸没于农杆菌菌液进行转化

卡那霉素选卡那霉素选

T.代择培养基筛择培养基筛择培养基筛

选种子选种子选种子

T代七代T：,代

①农杆菌转化To代植株并自交，将「代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性

个体即表示其基因组中插入了o

②Ti代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约—%

的培养基中幼苗继续培养。

③将②中选出的T2代阳性植株（填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）

所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到%的培养基中的幼苗

即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变

型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关

信息如图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。

野

生5'CCTTTTCATT.♦…0AGGACTCTGCCTT……TTACAAGTTA3'(

型3'GGAAAAGTAA........CTCCTGAGACGGAA........AATGTTCAAT5'

突

变5'CCTTTTCATT…®\GGACTCTGCCTT……TTACAAGTTA3'(]50bp)

型3'GGAAAAGTAA........CTCCTGAGACGGAA........AATGTTCAAT5'

10........50........(15()bp)

限制性内切核酸酶XAAGG；NNNNNNCCTT

识别及切割序列TTCCNNNNNN：GGAA网代表任意核甘酸）

核酸电泳图标准参照物野生型突变型

150bp

1（X）bp

50bp（bp指核甘酸对）

答案（1）野生型（2）载体启动子和终止子（3）①DV基因和卡那霉素抗性基因②75

③自交100

核酸电泳图标准参照物野生型突变型

150bp

1（M）bp

50bp（bp指核甘酸对）

解析（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型ZM/基因为显性基因，因

此采用农杆菌转化法将野生型基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则

转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。（2）利用PCR技术扩增ZM/基因后,

应该用同种限制性内切核酸酶对D4/基因和载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起

来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的上游，终止子位于目的基因的下游，因此为

确保插入的基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。（3）①根据题干信

息和图示分析，将To代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有D4/基因和卡那霉素抗性

基因）菌液中转化，再将获得的Ti代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养

基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入

了DV基因和卡那霉素抗性基因。②Ti代阳性植株都含有ZM/基因，由于T—DNA（其内部

基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点，所以不

确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，

其自交后代应该出现3：1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选

择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的

T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株

即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图

示分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp,野生型基因没有限制酶X的切割位点，

而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知，电泳图中，野生型只有

150bp,突变型有50bp和100bp。

【思维延伸］_判断与填充

(l)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生(2021•湖北，16)(V)

⑵利用蛋白质工程技术在No的a和p亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型脯

水合酶(Ni),加入连接肽需要通过改造基因实现(2021・辽宁，14)(V)

(3)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近(2019•江苏，10)(X)

提示：兔血液中的成熟红细胞没有DNA,因此等体积的兔血提取的DNA量小于鸡血。

⑷粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸偏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入

与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定

试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(2021•山东，13)(X)

提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸饵水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积

相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。

(5)(2018•江苏，32节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的匕端加上

限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA

片段能定向插入表达载体，减少自连。

(6)(2022.山东，25节选)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用

于扩增P基因的引物需满足的条件是能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸O

为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列

应添加在引物的5'端(填"3’端”或"5,端”)。

⑺(2019・江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设

计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR

鉴定时应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩

增出了400bp片段，原因是目的基因反向连接。

(8)(2019•全国I,38节选)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA

解链为单链的条件是加热至90℃以上。在PCR反应中使用hqDNA聚合酶而不使用大肠杆

菌DNA聚合酶的主要原因是TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下

会失活。

⑼（2023•海南，20节选）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，

可将外源基因递送到植物细胞中的原因是农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T—DNA

能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。

叵题组集训

题组一基因工程

1.如图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamnI和Sau3AI三种限制性内切

核酸酶的识别序列与切割位点，图2为某种基因表达载体的示意图（载体上的EcoRI,

SG/3AI的切点是唯一的）。请回答下列问题：

♦*1

一GAATTC一一GGATCC一—‘GATC一

—CTTAAG————CCTAGG——CTAG—

IIt

图1

（1）经BmzHl酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连

接，理由是o

（2）图2中启动子的作用是,

终止子的作用是,抗生素

抗性基因的作用是。

（3）构建基因表达载体时，还需要用到DNA连接酶。常见的DNA连接酶有DNA

连接酶和DNA连接酶，其中能连接平末端的是DNA连接酶。

（4）若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子（如

图3所示）。这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,

原因是___________________________________________________________________________

答案（1）5她3Al两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）RNA聚合酶识别和

结合的部位使转录过程停止便于重组DNA分子的筛选(3)E.coliT4T4(4)甲和丙

甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均

不能被转录

解析(1)经BamHI酶切后得到的黏性末端是GATC-,与Sau3AI酶切后获得的黏性末端

相同，所以经BmiHl酶切后得到的目的基因可以与被SOM3Al酶切后的产物连接。(2)启动

子是RNA聚合酶识别和结合的部位，与RNA聚合酶结合后，开始进行转录过程；终止子使

转录过程停止；抗生素抗性基因表达后，生物具有抗生素抗性，便于重组DNA分子的筛选。

(4)在基因表达载体中，目的基因应位于启动子和终止子之间才能表达。甲中目的基因插入在

启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。

2.(2023•鄂州高三联考)多酚氧化酶(PP。)基因的大量表达是促使果实褐变的主要原因之一。

科研人员将外源多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)与载体结合，构建PPO基因的反义表达

载体(重组质粒2),并在农杆菌介导下实现了对鸭梨组培苗的转化，其操作流程如图1,图中

限制酶SacI的识别序列为GAGCT,C,限制酶XbaI的识别序列为T,CTAGA,限制酶Hiwdlll

的识别序列为A’AGCTT,Ka/为卡那霉素抗性基因，aadA为链霉素抗性基因。请回答下列

问题：

鸭梨植株

图1

(1)多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)的获取：根据尸尸。基因3'端450bp的片段两侧的碱

基序列，设计引物进行过程①(以mRNA为模板进行的特殊PCR)。过程①中需要使用的酶有

,为使扩增出的ASPPO基因能与质粒2构建反义表达载体，

左、右侧引物(填“5'”或"3’”)端分别需要添加的序列是0

(2)ASPPO片段的克隆：将ASPPO片段与质粒1连接形成的重组质粒1导入大肠杆菌，该过

程需要预先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，其目的是o与体

外扩增相比，将重组质粒1导入大肠杆菌中扩增的优点有。

(3)PPO基因反义表达载体的构建：过程④中利用将ASPPO片段与质

粒2定向连接形成重组质粒2,导入农杆菌后进行筛选、测序鉴定，再使用(物理状

态)培养基扩大培养农杆菌。

(4)鸭梨的遗传转化：将预培养的鸭梨叶片愈伤组织置于上述农杆菌菌液中浸渍5min后，再

将愈伤组织转接到添加(抗生素)的选择培养基中培养。

(5)反义转基因鸭梨的检测：科研人员分别提取了非转基因鸭梨植株叶片及转基因鸭梨植株叶

片的总RNA,以PPO基因编码区全长为探针进行杂交检测转基因鸭梨的内源PPO基因转录

情况，结果如图2。该检测的原理是,实验结果表明植株（填

“A”或"B"）可能是成功实现转化的转基因植株。为进一步验证获得的转基因植株是否是

耐褐化新品种，还需进行的检测是。

图2

答案（1）逆转录酶和KzqDNA聚合酶5'GAGCTC,TCTAGA（2）使大肠杆菌细胞处于

一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态能准确复制、方便取用、稳定保存等

（3）（SacI、XbaI）限制酶和DNA连接酶液体（4）卡那霉素

（5）碱基互补配对A待植株开花结果后，观察果实是否褐变

解析（1）过程①是RT-PCR,需要使用的酶有逆转录酶和QqDNA聚合酶。为使扩增出的

ASPPO基因能与质粒2构建反义表达载体，左、右侧引物5'端分别需要添加的序列是SacI

和XbaI的识别序列GAGCTC,TCTAGA□（4）将预培养的鸭梨叶片愈伤组织置于农杆菌菌液

中浸渍5min,因为只有T—DNA进入愈伤组织细胞，因此用含卡那霉素的选择培养基进行

筛选。（5）探针杂交检测的原理是碱基互补配对，图中实验结果表明植株A的转录水平较低，

可能原因是反义RNA与尸尸。基因转录形成的RNA结合，从而更容易被RNA酶水解，使最

终表达量下降，所以A是成功实现转化的转基因植株。为进一步验证获得的转基因植株是否

是耐褐化新品种，还需待植株开花结果后，观察果实是否褐变。

题组二DNA片段的扩增及电泳鉴定

3.（2023•珠海高三期末）反转录PCR又称逆转录PCR（RT—PCR）,是以mRNA为模板进行的

特殊PCR,过程如图。下列相关叙述错误的是（）

5'------------------^3'mRNA

①口引物P1

3'^----------5,单链cDNA

引物P2②J

______________双链cDNA

A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物

B.RT—PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列

C.过程③中子链沿着模板链的5'—3,方向延伸

D.RT-PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测

答案C

解析过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3,端开始延伸DNA链，即子链沿着

模板链的3,一5'方向延伸，C错误。

4.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特

异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若

先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段。

据此分析，下列有关叙述错误的是（）

染色质

-bp

核酸酶处理泳三

印—800

部分水解的染色质

q—600

除去染色质蛋臼一400

DNA片段一200

A.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来

B.染色质中的蛋白质可能对DNA具有保护作用

C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核甘酸

D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DN