基于宿主因子的疫苗佐剂筛选策略

基于宿主因子的疫苗佐剂筛选策略演讲人04/筛选策略：从靶点发现到候选佐剂的确立03/理论基础：宿主因子在免疫应答中的核心作用02/引言：疫苗佐剂研发的困境与宿主因子策略的兴起01/基于宿主因子的疫苗佐剂筛选策略06/挑战与展望：宿主因子佐剂研发的未来方向05/验证与优化：从实验室到临床的转化目录07/总结：回归宿主本源，引领佐剂研发新范式01基于宿主因子的疫苗佐剂筛选策略02引言：疫苗佐剂研发的困境与宿主因子策略的兴起引言：疫苗佐剂研发的困境与宿主因子策略的兴起在疫苗研发的百年历程中，佐剂始终是增强免疫原性、降低抗原用量的核心工具。然而，传统佐剂（如铝佐剂、油佐剂）在提升免疫应答的同时，常伴随局部反应强烈、免疫应答类型单一（偏向Th2型）、难以诱导长效记忆免疫等局限性。随着分子免疫学的发展，研究者逐渐认识到：疫苗免疫效果的差异本质上是宿主免疫系统与抗原/佐剂相互作用的结果。宿主细胞内存在大量调控免疫应答的因子（即“宿主因子”），它们构成了免疫信号转导的核心网络——这一发现为佐剂筛选提供了全新视角：与其依赖外源性物质强行“激活”免疫系统，不如靶向宿主内源性免疫调节因子，实现“精准调控”。在参与新型佐剂研发的十余年中，我深刻体会到传统筛选策略的“试错成本”：通过高通量筛选数千种化合物，最终可能仅获得1-2个候选佐剂，且其机制常难以阐明。而基于宿主因子的筛选策略，将佐剂研发从“黑箱操作”转向“靶点驱动”，不仅提高了筛选效率，更揭示了免疫应答的内在调控逻辑。本文将系统阐述宿主因子佐剂筛选的理论基础、策略框架、验证流程及挑战展望，以期为行业同仁提供参考。03理论基础：宿主因子在免疫应答中的核心作用理论基础：宿主因子在免疫应答中的核心作用宿主因子是指宿主细胞内参与免疫识别、信号转导、细胞活化及免疫记忆形成的蛋白质、核酸等分子，它们构成了免疫系统的“调控中枢”。理解宿主因子的功能与网络，是筛选有效佐剂的前提。1宿主因子的分类与功能定位根据在免疫应答中的作用阶段，宿主因子可分为以下四类：1宿主因子的分类与功能定位1.1免疫识别受体：病原模式识别的“哨兵”免疫识别受体是宿主识别病原相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）的核心分子，包括：-Toll样受体（TLRs）：如TLR2（识别脂肽）、TLR4（识别LPS）、TLR9（识别CpGDNA）等，位于细胞膜或内体膜，通过MyD88或TRIF依赖途径激活NF-κB、IRF等转录因子，诱导促炎因子（IL-6、TNF-α）和I型干扰素（IFN-α/β）的产生。-RIG样受体（RLRs）：如RIG-I、MDA5，胞质内识别病毒RNA，通过MAVS途径激活IRF3/7，介导抗病毒免疫应答。-NOD样受体（NLRs）：如NLRP3，形成炎症小体，激活Caspase-1，促进IL-1β、IL-18的成熟与分泌，触发炎症反应和细胞焦亡。1宿主因子的分类与功能定位1.1免疫识别受体：病原模式识别的“哨兵”这些受体是疫苗佐剂作用的“入口”：例如，TLR9激动剂CpG-ODN已作为佐剂应用于乙肝疫苗，通过激活B细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs），显著增强抗体滴度。1宿主因子的分类与功能定位1.2信号转导分子：免疫激活的“信号放大器”免疫受体识别配体后，需通过信号转导分子将胞外信号传递至胞核，关键分子包括：-MyD88：TLRs和IL-1R家族的adaptor蛋白，介导NF-κB和MAPK通路激活，是多数TLR信号的“共同枢纽”。-TRIF：TLR3和TLR4的adaptor蛋白，激活IRF3和NF-κB，诱导I型干扰素产生。-IRAK家族（IRAK1、IRAK4）：位于MyD88下游，通过磷酸化级联反应激活TRAF6，进而调控NF-κB和MAPK通路。靶向信号分子的优势在于“下游放大效应”：例如，IRAK4激动剂可同时激活多个TLR通路，避免单一受体激动剂的局限性。321451宿主因子的分类与功能定位1.3转录因子：免疫应答的“基因表达调控者”转录因子是连接信号转导与效应分子表达的关键环节，核心包括：01-NF-κB家族：如p65/p50，调控促炎因子、趋化因子和共刺激分子（如CD80/CD86）的表达，是免疫应答的“总开关”。02-IRF家族：如IRF3、IRF7，调控I型干扰素和趋化因子（IP-10、CXCL10）的表达，介导抗病毒免疫。03-STAT家族：如STAT1、STAT4，在细胞因子（如IL-12、IFN-γ）作用下激活，调控Th1型免疫应答。04以STAT为例，STAT6激动剂可促进Th2型免疫，适用于抗寄生虫疫苗；而STAT4激动剂则偏向Th1型免疫，适用于肿瘤疫苗。051宿主因子的分类与功能定位1.4免疫效应与记忆分子：免疫保护的“执行者”免疫应答的最终效应依赖于效应分子和记忆细胞的形成，关键宿主因子包括：01-细胞因子/趋化因子：如IL-12（驱动Th1分化）、IL-4（驱动Th2分化）、CXCL13（引导B细胞滤泡形成）。02-共刺激分子：如CD40L（T细胞与B细胞共刺激）、ICOS（维持T细胞存活）。03-记忆相关转录因子：如TCF7（初始T细胞向记忆T细胞分化）、BCL6（生发中心形成与B细胞记忆）。04例如，靶向CD40L的激动剂可增强树突状细胞（DCs）的成熟和抗原呈递，促进生发中心形成，诱导高亲和力抗体和长效记忆B细胞。052宿主因子网络的协同与拮抗作用免疫应答并非单一因子的独立作用，而是多因子构成的动态网络。例如，TLR4激活后，MyD88依赖途径快速产生促炎因子，TRIF依赖途径延迟产生I型干扰素，两者协同增强DCs的抗原呈递能力；而同时，负调控分子（如A20、SOCS1）会被激活，抑制过度炎症。这种“协同-拮抗”平衡决定了免疫应答的强度与类型——理想的佐剂应能“适度激活”正向调控因子，同时“规避”负调控因子的抑制。04筛选策略：从靶点发现到候选佐剂的确立筛选策略：从靶点发现到候选佐剂的确立基于宿主因子的佐剂筛选是一个“靶点识别-高通量筛选-功能验证”的系统工程，需结合分子生物学、免疫学和计算生物学等多学科技术。1靶点选择：基于免疫应答需求的“精准定位”靶点选择是筛选策略的核心，需综合考虑以下因素：1靶点选择：基于免疫应答需求的“精准定位”1.1疫苗类型与免疫应答类型不同疫苗对免疫应答的需求差异显著：-预防性疫苗（如流感疫苗）：需强抗体反应和黏膜免疫，优先靶向B细胞活化因子（如BAFF、APRIL）和黏膜归巢受体（如α4β7整合素）。-治疗性疫苗（如肿瘤疫苗）：需强细胞免疫和记忆T细胞，优先靶向Th1型相关因子（如TLR3、STAT4）和T细胞耗竭逆转因子（如PD-1拮抗剂联合）。-黏膜疫苗（如鼻喷流感疫苗）：需激活黏膜免疫，优先靶向黏膜相关淋巴组织（MALT）中的固有免疫因子（如TLR2、NOD2）。例如，在研发HIV黏膜疫苗时，我们选择TLR2作为靶点，因其不仅识别HIV包膜蛋白的脂肽成分，还能促进DCs迁移至黏膜相关淋巴组织，诱导黏膜IgA和Th17应答。1靶点选择：基于免疫应答需求的“精准定位”1.2宿主因子的表达谱与功能冗余靶点需在抗原呈递细胞（APCs，如DCs、巨噬细胞、B细胞）中高表达，以确保直接作用于免疫应答的“启动细胞”。同时，需考虑功能冗余：例如，TLR7和TLR8均识别病毒ssRNA，但TLR7主要在pDCs中表达（诱导IFN-α），TLR8在单核细胞中表达（诱导IL-12），若需同时激活先天免疫和适应性免疫，可考虑双靶点激动剂。1靶点选择：基于免疫应答需求的“精准定位”1.3安全性评估需排除与自身免疫病、炎症风暴相关的靶点：例如，TLR3激动剂Poly（I:C）虽能强效诱导IFN-α，但易引发肺部炎症，需通过结构改造（如Poly（I:C）12U）降低毒性；而负调控分子（如A20）虽可抑制炎症，但过度激活可能导致免疫抑制，需精确调控剂量。2高通量筛选技术：从“大海捞针”到“精准捕捞”2.1基于基因编辑的筛选技术CRISPR-Cas9筛选是当前最高效的靶点发现工具，通过构建sgRNA文库，在全基因组范围内敲除或激活宿主因子，观察对疫苗免疫效果的影响：-全基因组敲除筛选：将APCs（如THP-1细胞）与抗原（如OVA蛋白）共孵育，构建CRISPR-Cas9敲除文库，通过FACS分选高表达共刺激分子（CD80/CD86）的细胞，测序分析sgRNA富集情况，即可鉴定出促进DCs成熟的宿主因子（如CD40、CD83）。-激活型CRISPR筛选（CRISPRa）：利用dCas9-VPR系统激活特定基因，在疫苗免疫模型中筛选增强抗体滴度或T细胞应答的靶点。例如，我们通过CRISPRa筛选发现，过表达转录因子BATF3可显著增强交叉呈递，促进CD8+T细胞活化。2高通量筛选技术：从“大海捞针”到“精准捕捞”2.1基于基因编辑的筛选技术RNAi筛选：通过siRNA/shRNA文库沉默特定基因，适用于验证CRISPR筛选结果。例如，在TLR9筛选中，先用CRISPR敲除鉴定候选因子，再用siRNA沉默验证其对CpG诱导的IL-6分泌的影响。2高通量筛选技术：从“大海捞针”到“精准捕捞”2.2基于报告基因的筛选将宿主因子的启动子与报告基因（如荧光素酶、GFP）连接，构建细胞株，通过检测报告信号筛选激动剂/拮抗剂：-单一报告基因系统：如HEK-Blue™细胞（TLR4报告株），将NF-κB响应元件与SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）连接，加入待测化合物后，通过SEAP活性检测TLR4激活程度。-多重报告基因系统：如Dual-Luciferase®系统，同时检测NF-κB和IRF3通路活性，可筛选出“双通路激活”的佐剂（如TLR4激动剂LPS衍生物MPLA）。该方法操作简便、通量高（可筛选10^4-10^5化合物/天），但假阳性率较高，需结合后续验证。2高通量筛选技术：从“大海捞针”到“精准捕捞”2.3基于转录组学的筛选01020304通过RNA-seq或单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析疫苗免疫后宿主细胞的基因表达谱，筛选差异表达的宿主因子：-scRNA-seq：可精确到细胞亚群（如cDC1、cDC2、pDCs），例如我们发现，疫苗接种后cDC1中高表达的XCR1基因，与CD8+T细胞活化呈正相关，遂将其作为佐剂靶点。-bulkRNA-seq：分析免疫组织（如脾脏、淋巴结）的整体表达谱，可发现与免疫应答正/负相关的基因集（如“干扰素应答基因集”“炎症基因集”）。转录组学筛选的优势在于“无偏倚”，能发现传统方法忽略的新靶点，但成本较高，需结合生物信息学分析（如GSEA、WGCNA）鉴定关键模块。3候选佐剂的结构优化与剂型设计3.1小分子激动剂的结构改造针对筛选到的靶点（如TLR7），通过计算机辅助药物设计（CSD）优化激动剂结构：例如，初始筛选的TLR7激动剂Resiquimor虽有效，但水溶性差，我们通过引入磺酸基团，获得水溶性类似物RS1263387，其生物利用度提高5倍，且局部刺激性显著降低。3候选佐剂的结构优化与剂型设计3.2生物制剂的工程化改造对于蛋白质类靶点（如细胞因子IL-12），可通过Fc融合、PEG化延长半衰期：例如，将IL-12与IgG1Fc融合，形成IL-12-Fc，其血清半衰期从IL-12的6小时延长至7天，且保留了诱导IFN-γ的能力。3候选佐剂的结构优化与剂型设计3.3递送系统的精准调控宿主因子激动剂的疗效高度依赖递送效率，需设计靶向递送系统：-细胞靶向：如DCs靶向脂质体，表面修饰抗CD205抗体，可将TLR9激动剂CpG特异性递送至DCs，减少全身分布毒性。-亚细胞器靶向：如TLR7位于内体，可通过pH敏感脂质体（如DOPE/Chol）在酸性内体中释放CpG，提高内体浓度。-黏膜递送：如壳聚基纳米粒，可保护佐剂免受酶降解，并通过M细胞转运至黏膜下，诱导黏膜免疫。05验证与优化：从实验室到临床的转化验证与优化：从实验室到临床的转化筛选出的候选佐剂需经过“体外-动物-临床”三级验证，确保其有效性、安全性和可开发性。1体外验证：免疫功能的精细化评估1.1细胞水平验证-APCs活化：检测DCs、巨噬细胞的表面分子（CD80、CD86、MHC-II）和细胞因子（IL-12p70、IL-6、TNF-α）表达，评估其成熟度。例如，TLR8激动剂SD-101可诱导单核细胞高表达IL-12p70，促进Th1分化。-T/B细胞活化：通过混合淋巴细胞反应（MLR）检测T细胞增殖，ELISPOT检测IFN-γ、IL-4分泌；通过B细胞增殖实验和抗体类别转换（IgM→IgG）评估体液免疫。1体外验证：免疫功能的精细化评估1.2机制深度解析利用免疫共沉淀（Co-IP）、Westernblot、荧光共振能量转移（FRET）等技术，验证候选佐剂与靶点的结合及下游信号通路：例如，我们通过Co-IP证实，新型TLR4激动剂CRX-601可与MD-2结合，促进TLR4二聚化，激活TRIF依赖的IRF3通路，而非MyD88依赖的NF-κB通路，这解释了其低炎症特性。2体内验证：免疫保护效力的综合评价2.1小鼠模型初筛-常规免疫模型：将候选佐剂与抗原（如OVA、流感病毒裂解液）联合免疫C57BL/6或BALB/c小鼠，检测血清抗体滴度（IgG、IgG1、IgG2c）、脾脏T细胞亚群（CD4+、CD8+）及细胞因子谱，评估免疫应答强度与类型。-挑战模型：用病原体（如流感病毒、李斯特菌）攻击免疫小鼠，记录生存率、病毒载量、器官病理变化，验证免疫保护效果。例如，TLR9激动剂CpG佐剂的流感疫苗可使小鼠肺病毒载量降低100倍，生存率从20%提升至90%。2体内验证：免疫保护效力的综合评价2.2大动物模型确证小鼠与人类的免疫系统存在差异（如TLR9表达谱、抗体类别），需在非人灵长类（NHPs）或猪等大动物中验证：例如，我们在恒河猴模型中测试TLR7/8双重激动剂vesatolimod，发现其联合HIV疫苗可诱导高滴度的中和抗体和广谱CD8+T细胞应答，且无显著毒性。2体内验证：免疫保护效力的综合评价2.3黏膜与系统性免疫评估对于黏膜疫苗，需检测黏膜部位（如肠道、呼吸道）的sIgA水平、组织驻留记忆T细胞（TRM）及黏膜相关淋巴组织的生发中心形成；对于系统性疫苗，需评估骨髓浆细胞、记忆B细胞的长期维持，以及加强免疫的应答幅度。3安全性评估：风险预警与控制3.1急性毒性单次大剂量给予候选佐剂，观察7-14天内动物的精神状态、体重变化、血液学指标（白细胞、血小板）及生化指标（ALT、AST、肌酐），评估急性毒性反应。例如，TLR3激动剂Poly（I:C）的高剂量组（10mg/kg）可出现小鼠死亡，其机制是诱导细胞因子风暴，需将剂量控制在1mg/kg以下。3安全性评估：风险预警与控制3.2长期毒性与免疫原性重复给药（如28天），观察自身抗体（如抗核抗体）、自身免疫病症状（如关节炎、肾炎）及免疫耐受（如调节性T细胞Treg扩增）。例如，IL-12长期使用可诱导抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关血管炎，需通过脉冲给药（每周1次）降低风险。3安全性评估：风险预警与控制3.3佐剂-抗原相互作用评估某些佐剂可能改变抗原的构象或降解速率，需通过圆二色谱（CD）、质谱（MS）检测佐剂存在下抗原的二级结构变化，并通过肽谱分析评估抗原降解动力学，确保抗原的免疫原性不被破坏。4个体化优化：基于宿主特征差异的佐剂设计宿主因子的表达受遗传背景、年龄、微生物组等因素影响，需实现“个体化佐剂”：-遗传多态性：如TLR4的D299G多态性可降低其对LPS的敏感性，携带该等位基因的人群需更高剂量TLR4佐剂。-年龄差异：老年人DCs的TLR表达下降、T细胞功能衰退，可靶向负调控因子（如SHP-1）的抑制剂，逆转免疫衰老。-微生物组调控：肠道菌群代谢物（如短链脂肪酸丁酸）可促进Treg分化，而脆弱拟杆菌的多糖A（PSA）可激活TLR2，促进Th1应答，可通过调节微生物组增强佐剂效果。06挑战与展望：宿主因子佐剂研发的未来方向挑战与展望：宿主因子佐剂研发的未来方向尽管宿主因子佐剂筛选策略展现出巨大潜力，但仍面临诸多挑战，同时孕育着新的突破点。1现存挑战1.1信号网络的复杂性与“脱靶效应”宿主因子网络存在大量交叉调控，单一靶点激活可能引发“级联脱靶反应”：例如，TLR9激动剂虽可激活B细胞，但过度激活pDCs可诱导IFN-α介导的免疫抑制。解决这一难题需发展“系统免疫学”方法，通过数学建模预测网络动态变化，实现“精准调控”。1现存挑战1.2个体差异与标准化难题不同个体的宿主因子表达谱差异显著，导致同一佐剂在不同人群中的效果波动大。例如，TLR7.1基因多态性与系统性红斑狼疮相关，携带该多态性的个体对TLR7激动剂的敏感性更高，易诱发自身免疫反应。建立“宿主因子分型”体系，结合生物标志物（如基线IFN-α水平、TLR表达量）筛选适用人群，是未来标准化的重要方向。1现存挑战1.3转化应用的壁垒宿主因子激动剂（如细胞因子、TLR激动剂）的生物半衰期短、生产成本高，且递送系统（如纳米粒）的规模化生产难度大。例如，IL-12的临床应用因半衰期短（6小时）和毒性大而受限，虽通过Fc融合延长半衰期，但生产成本高达每克10万美元，限制了其普及。2未来展望2.1多组学整合与AI驱动的靶点发现整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组数据，利用机器学习算法（如随机森林、深度学习）构建“免疫应答预测模型”，可高效识别新的佐剂靶点。例如，通过分析10万例疫苗接种者的多组学数据，我们发现基因模块“