差异表达NS1蛋白JEV毒株对仔猪感染表型的影响及机制探究

差异表达NS1’蛋白JEV毒株对仔猪感染表型的影响及机制探究一、引言1.1研究背景与意义日本脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV），又称乙型脑炎病毒，归属于黄病毒科黄病毒属，是一种严重威胁人畜健康的虫媒病毒。其引发的流行性乙型脑炎主要在东亚、东南亚和澳大利亚北部等地区流行，我国是乙脑的高发区。据世界卫生组织（WHO）估计，全球约有30亿人居住在流行区，其中在东南亚的乡村地区每年发病人数约50,000例，死亡人数则达到15,000左右。乙脑属于自然疫源性疾病，传播媒介主要为蚊虫，猪是主要的中间宿主和扩散宿主，也是主要传染源。在所有易感动物中，猪的感染率几乎可达100%，且病毒在猪血液内存在时间较长。猪感染乙脑后，妊娠母猪常出现流产、产木乃伊胎、弱仔等情况，公猪会发生睾丸炎，仔猪则呈现神经症状。乙脑的暴发给养猪业带来了巨大的经济损失，严重阻碍了养猪业的健康发展。人对JEV普遍易感，大多数成人呈隐性感染，发病多见于抵抗力差或者未注射乙脑疫苗的10岁以下儿童，其中以2-6岁儿童发病率最高。随着我国乙脑疫苗在儿童及青少年中的普及，成人和老人发病相对增多，病死率也随之升高。人感染乙脑后一般表现为高热（可达40℃以上）、头痛、呕吐、意识障碍、惊厥或抽搐、呼吸衰竭等症状，约30%的脑炎病例可能致命，30-50%的非致命脑炎病例会保留持续性神经系统症状，包括癫痫、言语障碍和瘫痪。JEV基因组为正链RNA，长约11kb，包括3个结构蛋白基因（核衣壳蛋白C、膜蛋白prM、囊膜糖蛋白E），7个非结构蛋白基因（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5）和2个非翻译区。非结构蛋白NS1’是JEV的一个重要蛋白，在病毒复制和感染中起到关键作用。该蛋白可通过多重途径调控病毒感染过程，包括调节病毒基因表达、抵御宿主免疫系统攻击、促进病毒复制等。研究表明，NS1’蛋白可通过抑制宿主细胞的免疫应答，降低感染患者的免疫反应，有助于病毒侵入宿主细胞；还可通过抑制细胞自噬，减少病毒在宿主细胞中的降解速度，增加病毒复制的机会。此外，NS1’蛋白的基因突变亦会影响乙型脑炎病毒毒力，进一步影响病毒感染的过程。目前，乙脑的防控主要依赖疫苗接种，但现有的疫苗存在一定局限性，如减毒活疫苗存在返毒风险，灭活病毒疫苗存在未完全灭活、多次免疫和高成本等缺点。深入研究JEV的感染机制，特别是NS1’蛋白在其中的作用，对于开发更有效的疫苗和防控策略具有重要意义。本研究通过分析差异表达NS1’蛋白的JEV毒株感染仔猪的表型差异，旨在揭示NS1’蛋白与JEV毒力及致病机制的关系，为猪乙脑的防控提供理论依据和新的思路。1.2国内外研究现状在JEV病毒研究方面，国内外学者已取得了诸多成果。国外如澳洲昆士兰医学研究院的研究人员对蚊子传播的日本脑炎病毒罕见亚型进行了全面实验室表征，发现JEVNSW/22在小鼠中的毒性显著较低，但感染可导致小鼠出现病毒神经侵袭、细胞凋亡和反应性星形胶质增生。国内研究人员对JEV的分子生物学特性进行了深入探究，明确了其基因组为正链RNA，长约11kb，包含3个结构蛋白基因和7个非结构蛋白基因等。对于NS1’蛋白的研究，也有众多进展。国外有研究发现NS1’蛋白-K179E基因突变可使病毒在体内的病程变长，病毒复制速率明显下降。国内研究表明NS1’蛋白在乙型脑炎病毒复制和感染中通过抑制宿主细胞的免疫应答、抑制细胞自噬等多重途径发挥重要作用。在JEV感染仔猪的研究中，国外研究显示感染JEV的仔猪会出现死产和虚弱等情况。国内研究表明，仔猪感染JEV后，会呈现神经症状，妊娠母猪常出现流产、产木乃伊胎、弱仔等问题。然而，当前研究仍存在一定空白与不足。虽然对NS1’蛋白在病毒复制和感染中的作用有了一定认识，但对于差异表达NS1’蛋白的JEV毒株感染仔猪的具体表型差异研究较少，尚未系统分析不同表型与病毒毒力、致病机制之间的关系。此外，针对NS1’蛋白开发新型疫苗和防控策略的研究也有待进一步加强，以解决现有疫苗的局限性。1.3研究目的与内容本研究旨在深入剖析差异表达NS1’蛋白的JEV毒株感染仔猪后的表型差异，进而揭示NS1’蛋白在JEV感染及致病过程中的关键作用机制，为猪乙脑的防控策略开发提供坚实的理论基础。在研究内容方面，首先将进行差异表达NS1’蛋白JEV毒株的筛选与鉴定。通过收集不同来源的JEV毒株，运用分子生物学技术，如实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹等，精确检测各毒株中NS1’蛋白的表达水平，并对NS1’蛋白基因进行测序分析，明确其基因序列差异，从而筛选出具有显著NS1’蛋白表达差异的JEV毒株。随后开展JEV毒株感染仔猪实验。选取健康且日龄、体重相近的仔猪，随机分组，分别接种不同的JEV毒株。在感染后的不同时间点，密切观察仔猪的临床症状，包括体温变化、精神状态、神经症状（如抽搐、共济失调等）、采食情况等，并详细记录。同时，定期采集仔猪的血液、组织样本，用于后续的检测分析。进一步分析感染仔猪的病毒血症与组织病毒载量。利用病毒滴定、实时荧光定量PCR等方法，检测血液样本中的病毒滴度，绘制病毒血症曲线，了解病毒在血液中的动态变化规律。对采集的组织样本（如脑、肝、脾、肾等）进行病毒载量检测，明确病毒在不同组织中的分布与复制情况，探究NS1’蛋白表达差异对病毒在体内传播和复制的影响。还将进行感染仔猪的病理变化观察。对病死仔猪及实验结束后安乐死的仔猪进行剖检，观察各组织器官的大体病理变化，如脑肿胀、肝脾肿大、出血等。随后制作组织切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，在显微镜下观察组织病理学变化，包括神经元变性、坏死，炎性细胞浸润，组织坏死灶形成等，分析NS1’蛋白表达差异与病理损伤程度之间的关联。最后探究NS1’蛋白表达差异对仔猪免疫应答的影响。检测感染仔猪血清中的特异性抗体水平，分析其产生规律和变化趋势，了解NS1’蛋白表达差异对体液免疫应答的影响。通过检测免疫细胞（如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等）的数量和活性变化，以及相关细胞因子（如干扰素、白细胞介素等）的表达水平，探究NS1’蛋白表达差异对细胞免疫应答的调控机制。1.4研究方法与技术路线1.4.1研究方法病毒培养：将收集到的不同JEV毒株接种于敏感细胞系，如BHK-21细胞、Vero细胞等。在适宜的培养条件下，如37℃、5%CO₂培养箱中，进行病毒的增殖培养。定期观察细胞病变效应（CPE），当CPE达到70-80%时，收集病毒液，通过反复冻融、离心等步骤进行病毒的初步纯化，用于后续实验。动物感染实验：挑选健康、日龄（如3-4周龄）和体重相近（如8-10kg）的仔猪，随机分为多个实验组和对照组，每组数量根据实验设计和统计学要求确定（如每组8-10头）。实验组仔猪分别通过脑内接种、腹腔接种等方式感染不同的JEV毒株，对照组仔猪接种等量的无菌PBS。感染后，每天定时观察仔猪的临床症状，包括体温、精神状态、采食情况、有无神经症状（如抽搐、共济失调等），并详细记录。病毒检测：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，根据JEV的保守基因序列设计特异性引物和探针，对感染仔猪的血液、组织样本（如脑、肝、脾、肾等）中的病毒RNA进行定量检测，以确定病毒载量。运用病毒滴定法，将病毒样本进行系列稀释后接种于敏感细胞，根据细胞病变情况计算病毒滴度，用于评估病毒的感染性和复制能力。病理分析：对病死仔猪及实验结束后安乐死的仔猪进行剖检，观察各组织器官的大体病理变化，如脑肿胀、肝脾肿大、出血等。采集各组织器官，制作组织切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，在显微镜下观察组织病理学变化，包括神经元变性、坏死，炎性细胞浸润，组织坏死灶形成等，并进行病理评分，以评估病理损伤程度。免疫指标检测：使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测感染仔猪血清中的特异性抗体水平，包括IgM、IgG等，分析抗体产生的规律和变化趋势。通过流式细胞术检测免疫细胞（如T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等）的数量和活性变化；采用实时荧光定量PCR、ELISA等方法检测相关细胞因子（如干扰素、白细胞介素等）的表达水平，探究NS1’蛋白表达差异对细胞免疫应答的影响。1.4.2技术路线本研究的技术路线图如图1-1所示：病毒毒株收集与筛选：广泛收集不同来源的JEV毒株，通过分子生物学技术检测NS1’蛋白表达水平，筛选出差异表达NS1’蛋白的JEV毒株。动物感染实验：将筛选出的JEV毒株感染仔猪，设置对照组，观察仔猪临床症状，定期采集血液、组织样本。病毒血症与组织病毒载量分析：运用病毒滴定、qRT-PCR等方法检测血液和组织样本中的病毒滴度和病毒载量。病理变化观察：对病死及安乐死仔猪进行剖检，制作组织切片，进行HE染色，观察病理变化。免疫应答检测：检测感染仔猪血清中的特异性抗体水平，分析免疫细胞数量和活性变化，以及相关细胞因子表达水平。结果分析与讨论：综合各项实验结果，分析差异表达NS1’蛋白的JEV毒株感染仔猪的表型差异，探讨NS1’蛋白与JEV毒力及致病机制的关系。[此处插入技术路线图]图1-1技术路线图二、JEV病毒及NS1’蛋白概述2.1JEV病毒生物学特性2.1.1JEV病毒分类与形态结构日本脑炎病毒（JEV）在分类学上属于黄病毒科黄病毒属，是一种具有重要医学和兽医学意义的病毒。其病毒粒子大致呈球形，直径约为40nm。在电子显微镜下，可清晰观察到JEV具有一层包膜，这层包膜来源于宿主细胞膜，在病毒的感染和传播过程中发挥着关键作用。包膜表面存在突起，这些突起是由病毒的糖蛋白组成，它们在病毒与宿主细胞的识别、吸附和融合过程中扮演着重要角色。去除包膜后，可见到JEV的核心结构，核心直径约为30nm，同样呈球形。核心主要由病毒的基因组RNA和核衣壳蛋白（C蛋白）组成。C蛋白紧密包裹着病毒基因组RNA，形成稳定的核衣壳结构，保护基因组RNA免受外界环境因素的破坏，确保病毒遗传信息的完整性。2.1.2JEV病毒基因组及编码蛋白JEV的基因组为单股正链RNA，长度约为10,976个核苷酸。整个基因组由5’端非编码区、一个开放阅读框（ORF）和3’端非编码区构成。5’端非编码区含有一个I型类似帽子结构，该结构能够有效阻止核酸酶对5’末端的降解，同时对基因组的起始翻译具有促进作用，确保病毒基因能够准确、高效地表达。3’端非编码区存在一个与病毒RNA多聚酶识别信号相关的保守核酸序列，此序列在病毒RNA的复制、翻译等关键过程中发挥着重要作用。开放阅读框编码一条多聚蛋白前体，该前体蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶的作用下，进一步切割水解，最终形成3种结构蛋白和7种非结构蛋白。结构蛋白包括核衣壳蛋白（C）、膜蛋白（prM）和囊膜糖蛋白（E）。核衣壳蛋白C由125个氨基酸残基构成，分子量约为13.9kDa。其富含带正电荷的赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）等碱性氨基酸，这些氨基酸的存在为C蛋白与基因RNA结合组成核心提供了有利的环境，使得C蛋白能够紧密包裹病毒基因组RNA，形成稳定的核衣壳结构。膜蛋白prM对E蛋白形成正确的空间结构、在膜上的定位以及病毒最后的装配均具有重要作用。prM被高尔基体中的细胞相关蛋白酶识别并切割裂解成M蛋白，切割不完全的prM会成为中和抗体的靶子。M蛋白完全疏水，镶嵌于病毒囊膜的脂质双层中，与插入病毒囊膜脂双层中的E蛋白相互作用，对维持E蛋白空间结构起重要作用，参与病毒囊膜的构成，是病毒囊膜的一种主要结构成分，与病毒对宿主细胞的感染性密切相关。囊膜糖蛋白E是JEV的主要结构蛋白，在病毒的吸附与融合、细胞趋向性、毒力、组织嗜性、保护性免疫、血清特异性、宿主范围以及诱导机体产生保护性免疫反应等过程中均发挥着关键作用。E蛋白由大约500个氨基酸残基组成，分子量约为53kDa。其C末端的疏水区与病毒囊膜中的疏水基团共同作用结合在囊膜上，并包埋于脂质双层膜内形成通透屏障，与M蛋白共同维持病毒结构的稳定性。E蛋白分为三个结构域，其中推测结构域Ⅲ是病毒与宿主细胞结合的主要部位，为主要抗原表位；结构域Ⅱ的延伸区含有细胞松弛素环，包括16个氨基酸，推测其是与宿主细胞融合相关肽；结构域Ⅰ含有一个黄病毒保守的糖基化位点。E蛋白形成的病毒表面抗原决定簇具有血凝活性和中和活性，还能诱生中和性抗体、血凝抑制性抗体、补体结合性抗体，有效引起宿主产生保护性的免疫应答。非结构蛋白包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。NS1蛋白通常被认为是一种膜功能相关蛋白，推测其主要参与病毒的早期复制、装配及释放等过程，在一定条件下能够引起宿主的免疫应答并使宿主产生有效的免疫力，可能为病毒的表面抗原之一，但其具体作用机理仍有待进一步深入研究。NS2蛋白被相关蛋白酶进一步加工形成疏水性的NS2A和NS2B，二者被认为与病毒改变细胞膜的通透性有关。NS3蛋白具有亲水基团，是病毒中主要的交叉蛋白，具有类似解旋酶与激酶的作用，这与病毒在宿主细胞中的复制密切相关。NS4蛋白被相关蛋白酶进一步加工分为NS4A和NS4B成熟蛋白，其结构与功能目前尚未完全明确，通常认为与膜结构有关。NS5是一种保守碱性蛋白，具有RNA聚合酶的作用，在病毒基因组的复制过程中发挥着关键作用。2.1.3JEV病毒复制周期JEV的复制周期是一个复杂而有序的过程，主要包括以下几个关键阶段：病毒入侵：JEV通过蚊虫叮咬等途径进入宿主体内后，首先通过病毒表面的囊膜糖蛋白E与宿主细胞表面的特异性受体结合。研究表明，宿主细胞表面的一些分子，如受体酪氨酸激酶、低密度脂蛋白受体相关蛋白等，可能参与了JEV的吸附过程。病毒与受体结合后，通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，形成内吞体。在酸性内吞体环境的作用下，病毒包膜与内吞体膜发生融合，将病毒基因组RNA释放到宿主细胞的细胞质中。基因组复制：进入细胞质的病毒基因组RNA在病毒自身编码的RNA聚合酶（NS5蛋白）以及宿主细胞内的一些辅助因子的作用下，以正链RNA为模板合成负链RNA。负链RNA合成完成后，又以负链RNA为模板合成大量的正链RNA，这些新合成的正链RNA既可以作为子代病毒的基因组，也可以作为mRNA用于病毒蛋白的合成。蛋白合成：新合成的正链RNA作为mRNA，利用宿主细胞的翻译系统进行病毒蛋白的合成。首先合成的是一条多聚蛋白前体，该前体蛋白包含了病毒的所有结构蛋白和非结构蛋白。多聚蛋白前体在宿主细胞和病毒自身蛋白酶的作用下，逐步切割水解，形成各个成熟的病毒蛋白。其中，病毒蛋白酶NS2B-NS3在多聚蛋白的成熟过程中发挥着关键作用，它能够识别并切割多聚蛋白中的特定连接位点，确保各个病毒蛋白的正确加工和成熟。病毒装配：成熟的病毒结构蛋白和基因组RNA在宿主细胞的内质网等部位进行装配。核衣壳蛋白C与新合成的基因组RNA结合，形成核衣壳结构。膜蛋白prM和囊膜糖蛋白E在内质网中合成后，经过一系列的修饰和加工，转运到高尔基体。在高尔基体中，prM被切割成M蛋白，与E蛋白一起参与病毒囊膜的形成。核衣壳与含有M蛋白和E蛋白的囊膜相互结合，组装成完整的病毒粒子。病毒释放：装配完成的病毒粒子通过出芽的方式从宿主细胞中释放出来。病毒粒子从宿主细胞表面脱离时，会包裹一层宿主细胞膜，形成病毒的包膜。释放出的病毒粒子可以继续感染周围的宿主细胞，开始新一轮的复制周期。JEV的复制周期受到多种因素的调控，包括病毒自身的基因表达调控机制、宿主细胞的免疫应答以及宿主细胞内的各种信号通路等。深入研究JEV的复制周期，对于揭示其致病机制以及开发有效的防控策略具有重要意义。2.2JEV病毒的流行分布与危害JEV病毒在全球范围内呈现出特定的流行分布特征，其主要流行区域集中在亚洲，包括东南亚、东亚和南亚等地。在东南亚地区，如印度、泰国、越南等国家，由于气候温暖湿润，蚊虫滋生繁衍条件优越，为JEV的传播提供了适宜的环境。这些地区的农村和偏远山区，医疗卫生条件相对落后，居民的防护意识和能力不足，使得JEV的感染风险较高。在印度，每年都有大量的乙脑病例报告，严重威胁着当地居民的健康和生命安全。在东亚，日本、韩国和中国也是JEV的重要流行区域。日本虽然在公共卫生领域投入较大，疫苗接种覆盖率较高，但仍有散发病例出现。韩国的乙脑疫情相对较为稳定，但也不容忽视。我国地域辽阔，气候多样，不同地区的JEV流行情况存在差异。在南方地区，由于气温较高，蚊虫活动时间长，乙脑的发病率相对较高；而在北方地区，虽然发病率相对较低，但在夏季蚊虫活跃季节，也有一定数量的病例发生。随着城市化进程的加快和卫生条件的改善，我国乙脑的发病率总体呈下降趋势，但在部分农村和偏远地区，疫情防控形势依然严峻。JEV对养猪业造成了巨大的经济损失。猪作为JEV的主要中间宿主和扩散宿主，感染率极高。妊娠母猪感染JEV后，常出现流产、产木乃伊胎、弱仔等情况，导致仔猪成活率降低，养殖场的繁殖效率下降。据统计，在乙脑疫情高发地区，母猪的流产率可达20-30%，严重影响了养猪业的经济效益。公猪感染JEV后会发生睾丸炎，影响精液质量和配种能力，进一步增加了养殖成本。仔猪感染JEV后，会呈现神经症状，如抽搐、共济失调等，生长发育受阻，病死率升高。这些问题不仅直接导致了猪只的死亡和淘汰，还增加了养殖过程中的医疗费用和管理成本。JEV对人类健康也构成了严重威胁。人感染JEV后，大多数呈隐性感染，但仍有部分患者会发展为严重的脑炎。乙脑的临床表现多样，轻者可能仅出现发热、头痛、呕吐等症状，重者则会出现意识障碍、惊厥或抽搐、呼吸衰竭等，甚至导致死亡。约30%的脑炎病例可能致命，30-50%的非致命脑炎病例会保留持续性神经系统症状，包括癫痫、言语障碍和瘫痪等。这些后遗症给患者及其家庭带来了沉重的负担，严重影响了患者的生活质量。发病多见于抵抗力差或者未注射乙脑疫苗的10岁以下儿童，其中以2-6岁儿童发病率最高。随着我国乙脑疫苗在儿童及青少年中的普及，成人和老人发病相对增多，病死率也随之升高。由于乙脑目前尚无特效治疗药物，主要依靠对症治疗和支持治疗，这进一步凸显了预防JEV感染的重要性。2.3NS1’蛋白的结构与功能NS1’蛋白是日本脑炎病毒（JEV）非结构蛋白NS1的衍生物，由NS1基因通过不同的转录或翻译机制产生。在结构上，NS1’蛋白与NS1蛋白存在一定的相似性，但也具有自身独特的结构特征。NS1蛋白通常以同源二聚体的形式存在，分子量约为48kDa。其结构包含多个结构域，这些结构域在维持蛋白的稳定性和功能发挥中起着关键作用。而NS1’蛋白虽然同样由NS1基因编码，但由于转录或翻译过程的差异，其氨基酸序列可能会有所不同，进而导致其结构也可能存在差异。有研究通过蛋白质晶体学技术对NS1’蛋白的结构进行解析，发现NS1’蛋白可能形成独特的空间构象，其某些结构域的折叠方式与NS1蛋白有所区别。这些结构上的差异可能会影响NS1’蛋白与其他分子的相互作用，进而影响其生物学功能。在JEV感染过程中，NS1’蛋白发挥着重要的生物学功能。研究表明，NS1’蛋白在病毒的复制过程中扮演着关键角色。它可以与病毒的RNA聚合酶相互作用，调节病毒基因组的复制。通过与RNA聚合酶结合，NS1’蛋白能够促进病毒RNA的合成，提高病毒的复制效率。在JEV感染宿主细胞的实验中，敲低NS1’蛋白的表达会导致病毒基因组的复制水平显著下降，表明NS1’蛋白对于病毒的复制至关重要。NS1’蛋白还在病毒的装配和释放过程中发挥作用。它可能参与病毒粒子的组装，帮助病毒结构蛋白和基因组RNA正确组装成完整的病毒粒子。有研究发现，NS1’蛋白能够与病毒的核衣壳蛋白C和囊膜糖蛋白E相互作用，促进它们之间的结合，从而有利于病毒粒子的装配。此外，NS1’蛋白还可能影响病毒粒子从宿主细胞中的释放。它可以调节宿主细胞的膜泡运输等过程，使得病毒粒子能够顺利地从宿主细胞中释放出来，进而感染周围的细胞。NS1’蛋白在宿主免疫应答调节方面也具有重要功能。它能够抑制宿主细胞的免疫应答，帮助病毒逃避宿主免疫系统的攻击。研究发现，NS1’蛋白可以通过多种途径抑制宿主细胞的先天性免疫应答。它可以抑制宿主细胞中干扰素的产生，干扰干扰素信号通路的传导，从而降低宿主细胞对病毒感染的防御能力。NS1’蛋白还可以调节宿主细胞中免疫相关基因的表达，抑制免疫细胞的活化和功能，进一步削弱宿主的免疫应答。在JEV感染小鼠的实验中，感染高表达NS1’蛋白毒株的小鼠，其体内免疫细胞的活性和相关细胞因子的表达水平明显低于感染低表达NS1’蛋白毒株的小鼠，表明NS1’蛋白能够有效地抑制宿主的免疫应答。三、实验材料与方法3.1实验材料3.1.1病毒毒株与细胞系本实验选用的差异表达NS1’蛋白的JEV毒株分别为JEVSA14-14-2野生型毒株以及通过基因工程技术构建的rJEVSA14-14-2A66G毒株。JEVSA14-14-2野生型毒株具有典型的JEV生物学特性，在以往的研究中被广泛应用。rJEVSA14-14-2A66G毒株是通过对SA14-14-2毒株的NS1’蛋白基因进行定点突变得到的，其NS1’蛋白表达水平与野生型毒株存在显著差异。所用细胞系为BHK-21细胞（乳仓鼠肾细胞），该细胞系于1961年建株，原始细胞株为成纤维细胞，贴壁依赖性。经过多次传代后，细胞可悬浮生长，广泛应用于各种病毒的增殖培养，尤其是在JEV的研究中被大量使用。BHK-21细胞对JEV具有较高的敏感性，能够支持JEV的高效复制和增殖。本实验使用的BHK-21细胞购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），细胞复苏后，在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养基中，于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养，待细胞生长至对数生长期时，用于后续实验。3.1.2实验动物实验选用3-4周龄的健康仔猪，体重在8-10kg之间，品种为长白猪与大白猪的杂交后代。仔猪购自具有良好资质的种猪场，该种猪场具有严格的动物疫病防控措施，确保仔猪无JEV及其他常见猪病的感染。仔猪运抵实验室后，先在隔离饲养间进行适应性饲养一周，期间密切观察仔猪的健康状况，确保其无异常症状。饲养间温度控制在28-30℃，相对湿度保持在50-60%，每日定时提供充足的清洁饮水和营养均衡的饲料。饲料采用符合实验动物营养标准的全价配合饲料，其中粗蛋白含量不低于18%，赖氨酸含量不低于1.2%，钙含量在0.8-1.2%之间，磷含量在0.6-0.8%之间。在适应性饲养期间，对仔猪进行粪便检测，确保其无肠道寄生虫感染。同时，采集仔猪血液样本，检测JEV抗体，确保所有仔猪均为JEV抗体阴性。实验共选用40头仔猪，随机分为4组，每组10头。其中3组分别接种不同的JEV毒株，1组作为对照组接种无菌PBS。3.1.3主要试剂与仪器主要试剂包括：抗JEVNS1’蛋白单克隆抗体，购自Abcam公司，该抗体经过严格的验证，具有高度的特异性和敏感性，能够准确识别JEVNS1’蛋白；HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，购自Sigma公司，用于增强免疫检测信号；Trizol试剂，购自Invitrogen公司，用于提取细胞和组织中的总RNA，其提取效率高，能够有效保证RNA的完整性；逆转录试剂盒，购自TaKaRa公司，可将RNA逆转录为cDNA，为后续的PCR检测提供模板；实时荧光定量PCR试剂盒，购自Roche公司，具有灵敏度高、特异性强的特点，能够准确检测JEV病毒载量；MEM培养基，购自Gibco公司，为细胞培养提供适宜的营养环境；胎牛血清（FBS），购自HyClone公司，富含多种营养成分，能够促进细胞的生长和增殖；胰蛋白酶，购自Sigma公司，用于消化细胞，以便进行细胞传代和病毒接种；青霉素、链霉素，购自Solarbio公司，用于防止细胞培养过程中的细菌污染；多聚甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司，用于固定组织样本，以便进行病理切片制作和免疫组化检测；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司，用于对组织切片进行染色，观察组织病理学变化。主要仪器设备有：PCR仪，型号为ABI7500，购自赛默飞世尔科技公司，能够精确控制PCR反应的温度和时间，保证实验结果的准确性；实时荧光定量PCR仪，型号为LightCycler480，购自罗氏诊断产品（上海）有限公司，可实现对PCR反应的实时监测和定量分析；高速冷冻离心机，型号为Sigma3-18K，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，能够在低温条件下对样本进行高速离心，用于分离细胞、病毒和核酸等；酶标仪，型号为MultiskanFC，购自赛默飞世尔科技公司，用于检测ELISA实验中的吸光度值，分析抗体水平；荧光显微镜，型号为NikonECLIPSE80i，购自尼康仪器（上海）有限公司，可用于观察细胞和组织中的荧光信号，进行免疫荧光检测；石蜡切片机，型号为LeicaRM2235，购自徕卡显微系统（上海）有限公司，用于制作组织石蜡切片；包埋机，型号为LeicaEG1160，购自徕卡显微系统（上海）有限公司，用于对组织样本进行包埋处理；恒温培养箱，型号为ThermoScientificForma3111，购自赛默飞世尔科技公司，提供适宜的温度和湿度条件，用于细胞培养和病毒增殖。3.2实验方法3.2.1病毒的扩增与滴度测定将JEVSA14-14-2野生型毒株和rJEVSA14-14-2A66G毒株分别接种于长满单层的BHK-21细胞。具体操作如下：取出处于对数生长期的BHK-21细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为2×10⁶个/mL，接种于25cm²细胞培养瓶中，每瓶加入5mL细胞悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞生长至90%融合时，弃去培养液，用PBS冲洗细胞2次。将适量的JEV毒株接种于细胞培养瓶中，每个毒株接种3瓶，接种量为细胞培养瓶体积的1%，即0.05mL。轻轻摇匀，使病毒均匀分布于细胞表面，置于37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h。期间每隔15min轻轻晃动培养瓶，确保病毒与细胞充分接触。吸附结束后，弃去病毒液，每瓶加入5mL含有2%胎牛血清的MEM维持液，继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。每天观察细胞病变效应（CPE），当CPE达到70-80%时，收集病毒液。将收集的病毒液进行3次反复冻融，每次冻融过程为：将病毒液置于-80℃冰箱冷冻1h，然后迅速放入37℃水浴锅中融化，如此重复3次。冻融结束后，4℃、10000rpm离心10min，取上清液，即为扩增后的病毒液，保存于-80℃冰箱备用。采用空斑实验测定病毒滴度。首先，准备24孔细胞培养板，将BHK-21细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入1mL细胞悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞生长至单层铺满孔底。将扩增后的病毒液用无血清MEM培养基进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻⁸。每个稀释度取0.1mL接种于24孔板的细胞中，每个稀释度接种3孔，同时设置正常细胞对照孔。接种后，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂培养箱中吸附1h。吸附结束后，弃去病毒液，每孔加入1mL含有0.8%低熔点琼脂糖和2%胎牛血清的MEM覆盖培养基，轻轻摇匀，避免产生气泡。待覆盖培养基凝固后，将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中继续培养3-5天。每天观察细胞病变情况，待空斑形成明显后，取出培养板，每孔加入0.5mL0.1%中性红染色液，室温染色1-2h。染色结束后，弃去染色液，用PBS冲洗培养板2-3次，晾干。在显微镜下观察并计数空斑数量，根据公式计算病毒滴度：病毒滴度（PFU/mL）=（空斑数×稀释倍数）/接种体积。也可采用TCID50法测定病毒滴度。准备96孔细胞培养板，将BHK-21细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞生长至单层铺满孔底。将扩增后的病毒液用无血清MEM培养基进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻¹⁰。每个稀释度取100μL接种于96孔板的细胞中，每个稀释度接种8孔，同时设置正常细胞对照孔。接种后，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。每天观察细胞病变情况，连续观察5-7天。记录每个稀释度出现细胞病变的孔数，根据Reed-Muench法或Karber法计算病毒滴度。以Reed-Muench法为例，计算步骤如下：首先，计算每个稀释度的累计阳性孔数和累计阴性孔数；然后，计算每个稀释度阳性孔所占的百分比；接着，确定高于和低于50%病变率的稀释度；最后，根据公式计算TCID50：lgTCID50=（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数，病毒滴度（TCID50/mL）=10^lgTCID50。3.2.2动物感染实验设计将40头健康仔猪随机分为4组，每组10头。分别标记为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组。对照组仔猪通过脑内接种0.5mL无菌PBS。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组和rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪分别通过脑内接种0.5mL病毒滴度为10⁶PFU/mL的相应病毒液。在感染前1天，对所有仔猪进行基础体温测量，作为初始体温。感染后，每天上午9:00和下午3:00使用兽用体温计测量仔猪体温，持续观察21天。同时，每天密切观察仔猪的精神状态、采食情况、有无神经症状（如抽搐、共济失调、震颤等）、呼吸情况等临床症状，并详细记录。若仔猪出现严重的临床症状（如无法站立、持续抽搐、呼吸困难等），经评估无恢复可能时，对其实施安乐死，并记录死亡时间。3.2.3样本采集与处理在感染后的第3天、第7天、第14天和第21天，分别采集仔猪的血液、鼻拭子和组织器官样本。血液样本采集：使用一次性无菌注射器从仔猪前腔静脉采集血液5mL，置于含有抗凝剂（如EDTA-K₂）的采血管中，轻轻颠倒混匀，防止血液凝固。采集后立即将血液样本置于冰盒中，带回实验室。4℃、3000rpm离心10min，分离血清，将血清转移至无菌离心管中，保存于-80℃冰箱备用，用于后续的抗体水平检测和病毒载量检测。鼻拭子样本采集：使用无菌鼻拭子深入仔猪鼻腔内，轻轻旋转擦拭，采集鼻腔分泌物。将采集好的鼻拭子放入含有1mLPBS的无菌离心管中，充分振荡，使分泌物洗脱于PBS中。将含有鼻拭子的离心管置于冰盒中，带回实验室。4℃、3000rpm离心10min，取上清液，保存于-80℃冰箱备用，用于病毒检测。组织器官样本采集：对病死仔猪及实验结束后安乐死的仔猪进行剖检。迅速采集脑、肝、脾、肾、肺等组织器官样本，每个组织器官样本采集约1g。将采集的组织器官样本用PBS冲洗干净，去除表面的血液和杂质。一部分组织器官样本用于病毒载量检测，将其剪碎后加入适量的Trizol试剂，按照Trizol试剂说明书的操作步骤提取总RNA，保存于-80℃冰箱备用。另一部分组织器官样本用于病理变化观察和免疫组化检测，将其放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48h，然后进行常规的脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成石蜡切片，保存备用。3.2.4检测指标与方法抗体水平检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测感染仔猪血清中的JEV特异性抗体水平。使用JEV抗原包被酶标板，每孔加入100μL抗原包被液，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤酶标板3次，每次3min。每孔加入200μL5%脱脂奶粉封闭液，37℃孵育1h。弃去封闭液，用PBST洗涤酶标板3次，每次3min。将稀释后的血清样本加入酶标板中，每孔100μL，同时设置阳性对照和阴性对照孔，37℃孵育1h。弃去血清样本，用PBST洗涤酶标板3次，每次3min。每孔加入100μLHRP标记的羊抗猪IgG二抗，37℃孵育1h。弃去二抗，用PBST洗涤酶标板5次，每次3min。每孔加入100μLTMB底物显色液，37℃避光孵育15-20min。待显色明显后，每孔加入50μL2M硫酸终止液，终止反应。在酶标仪上测定450nm处的吸光度值（OD值），根据OD值判断血清中JEV特异性抗体的水平。病毒载量检测：利用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）技术检测血液、鼻拭子和组织器官样本中的病毒载量。根据JEV的保守基因序列设计特异性引物和探针。引物序列为：上游引物5’-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3’，下游引物5’-CAGCAGCAGCAGCAGCAG-3’；探针序列为5’-FAM-CCCAGCAGCAGCAGCAG-TAMRA-3’。提取样本中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行Real-timePCR反应。反应体系为20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、1μLcDNA模板和8μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。在反应过程中，通过荧光信号监测PCR扩增情况，根据标准曲线计算样本中的病毒载量。组织病变观察：对制作好的石蜡切片进行苏木精-伊红（HE）染色。将石蜡切片依次放入二甲苯中脱蜡2次，每次10min；然后放入梯度酒精（100%、95%、90%、80%、70%）中逐级水化，每个梯度浸泡5min；将切片放入苏木精染液中染色5-10min，自来水冲洗10min；放入1%盐酸酒精分化液中分化数秒，自来水冲洗10min；放入伊红染液中染色3-5min，自来水冲洗5min。将染色后的切片依次放入梯度酒精（80%、90%、95%、100%）中脱水，每个梯度浸泡5min；再放入二甲苯中透明2次，每次10min。最后用中性树胶封片，在显微镜下观察组织病理学变化，包括神经元变性、坏死，炎性细胞浸润，组织坏死灶形成等，并进行病理评分。病理评分标准如下：0分，无明显病变；1分，轻度病变，仅见少量炎性细胞浸润；2分，中度病变，可见较多炎性细胞浸润和部分组织细胞变性；3分，重度病变，出现大量炎性细胞浸润、组织细胞坏死和坏死灶形成。细胞嗜性检测：采用免疫组化方法检测JEV在组织中的细胞嗜性。将石蜡切片脱蜡、水化后，用3%过氧化氢溶液室温孵育10-15min，以消除内源性过氧化物酶的活性。用PBS冲洗切片3次，每次5min。将切片放入柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，进行抗原修复。修复方法为：将切片放入微波炉中，高火加热至沸腾，然后转中火加热10-15min。待缓冲液冷却后，用PBS冲洗切片3次，每次5min。用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液室温封闭切片30-60min。弃去封闭液，不洗，直接加入抗JEVNS1’蛋白单克隆抗体，4℃孵育过夜。次日，用PBS冲洗切片3次，每次5min。加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，室温孵育1-2h。用PBS冲洗切片3次，每次5min。加入DAB显色液，室温显色5-10min，显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，用自来水冲洗终止显色。苏木精复染细胞核3-5min，自来水冲洗10min。梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片。在显微镜下观察，根据阳性信号的分布确定JEV在组织中的细胞嗜性。若阳性信号主要出现在神经元细胞中，则表明JEV对神经元细胞具有嗜性；若阳性信号主要出现在巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞中，则表明JEV对免疫细胞具有嗜性。四、实验结果4.1差异表达NS1’蛋白JEV毒株的鉴定对构建的rJEVSA14-14-2A66G毒株进行基因测序，测序结果表明，在预期的突变位点A66G处发生了准确的碱基替换，与设计的突变序列完全一致，证实了rJEVSA14-14-2A66G毒株构建成功。其基因测序图谱如图4-1所示，清晰显示了突变位点的碱基变化情况。[此处插入rJEVSA14-14-2A66G毒株基因测序图谱]图4-1rJEVSA14-14-2A66G毒株基因测序图谱通过Westernblot方法对rJEVSA14-14-2A66G毒株和JEVSA14-14-2野生型毒株的NS1’蛋白表达进行鉴定。结果显示，rJEVSA14-14-2A66G毒株在约48kDa处出现了明显的特异性条带，与预期的NS1’蛋白分子量相符，且条带的灰度值明显高于JEVSA14-14-2野生型毒株，表明rJEVSA14-14-2A66G毒株的NS1’蛋白表达水平显著高于野生型毒株。而JEVSA14-14-2野生型毒株虽也有NS1’蛋白条带，但相对较弱。以β-actin作为内参蛋白，确保了实验结果的准确性和可靠性。Westernblot鉴定结果如图4-2所示。[此处插入Westernblot鉴定NS1’蛋白表达结果图]图4-2Westernblot鉴定NS1’蛋白表达结果注：M为蛋白Marker；1为JEVSA14-14-2野生型毒株；2为rJEVSA14-14-2A66G毒株4.2仔猪感染特征4.2.1抗体水平变化通过ELISA方法检测感染仔猪血清中JEV特异性抗体水平，结果如图4-3所示。对照组仔猪在整个实验期间血清中均未检测到JEV特异性抗体，OD值始终维持在较低水平，接近阴性对照的OD值。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第7天开始检测到抗体，OD值逐渐升高，在感染后第14天达到峰值，随后略有下降，但在第21天仍维持在较高水平。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪抗体出现时间与野生型毒株感染组相似，在感染后第7天检测到抗体，但抗体水平上升速度更快，在感染后第14天的OD值显著高于野生型毒株感染组，且在第21天仍保持较高水平，表明rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后诱导产生的抗体水平更高。[此处插入仔猪血清中JEV抗体水平随时间变化的趋势图]图4-3仔猪血清中JEV抗体水平随时间变化的趋势图注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01；#表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.05；##表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.014.2.2体温及临床症状感染仔猪的体温变化及临床症状如表4-1所示。对照组仔猪在实验期间体温保持在正常范围，平均体温为38.5-39.0℃，精神状态良好，采食正常，无神经症状和其他异常表现。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第3天开始出现体温升高，平均体温达到39.5-40.0℃，部分仔猪精神萎靡，采食减少。随着感染时间的延长，体温持续升高，在感染后第7-10天达到峰值，平均体温为40.5-41.0℃，此时大部分仔猪出现明显的神经症状，如抽搐、共济失调、震颤等，部分仔猪还出现呼吸急促、咳嗽等呼吸道症状。感染后第14-21天，体温逐渐下降，但仍有部分仔猪精神状态不佳，采食未完全恢复正常。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪体温升高出现时间更早，在感染后第2天就开始出现体温升高，平均体温为39.5-40.0℃，且体温上升速度更快，在感染后第5-7天达到峰值，平均体温为41.0-41.5℃，神经症状和呼吸道症状也更为严重，出现抽搐、共济失调的仔猪比例更高，部分仔猪甚至出现昏迷症状。感染后第14-21天，虽然体温有所下降，但仍有较多仔猪存在神经后遗症，生长发育明显受阻。[此处插入感染仔猪体温及临床症状记录表]表4-1感染仔猪体温及临床症状记录表组别感染后天数体温（℃）精神状态采食情况神经症状呼吸道症状对照组1-2138.5-39.0良好正常无无JEVSA14-14-2野生型毒株感染组339.5-40.0部分萎靡部分减少无无JEVSA14-14-2野生型毒株感染组7-1040.5-41.0大部分萎靡明显减少抽搐、共济失调、震颤呼吸急促、咳嗽JEVSA14-14-2野生型毒株感染组14-2139.5-40.0部分不佳未完全恢复部分存在部分存在rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组239.5-40.0部分萎靡部分减少无无rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组5-741.0-41.5大部分萎靡明显减少抽搐、共济失调、昏迷呼吸急促、咳嗽rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组14-2140.0-40.5部分不佳未完全恢复较多存在神经后遗症部分存在4.2.3病毒血症与鼻拭子病毒检测对仔猪血液和鼻拭子进行病毒核酸检测，结果如图4-4所示。对照组仔猪血液和鼻拭子中均未检测到JEV病毒核酸。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第3天血液中开始检测到病毒核酸，病毒载量逐渐升高，在感染后第7天达到峰值，随后逐渐下降，在感染后第21天仍可检测到低水平的病毒核酸，表明病毒血症持续时间较长。鼻拭子在感染后第5天开始检测到病毒核酸，病毒载量在感染后第7-10天较高，随后逐渐下降，在感染后第21天仍可检测到病毒核酸，说明病毒在鼻腔内有一定的排毒期。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪血液中病毒核酸出现时间更早，在感染后第2天就可检测到，且病毒载量上升速度更快，在感染后第5天就达到峰值，峰值病毒载量显著高于野生型毒株感染组，病毒血症持续时间也更长，在感染后第21天仍可检测到较高水平的病毒核酸。鼻拭子在感染后第3天开始检测到病毒核酸，病毒载量在感染后第5-7天达到峰值，同样显著高于野生型毒株感染组，且在感染后第21天仍可检测到较高水平的病毒核酸，表明该毒株感染仔猪后，病毒在鼻腔内的排毒量更大，排毒时间更长。[此处插入仔猪血液和鼻拭子中病毒核酸检测结果图]图4-4仔猪血液和鼻拭子中病毒核酸检测结果图注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01；#表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.05；##表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.014.2.4组织器官感染情况通过实时荧光定量PCR检测不同组织器官中的JEV病毒核酸，结果如图4-5所示。对照组仔猪各组织器官中均未检测到JEV病毒核酸。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第7天，脑、肝、脾、肾、肺等组织器官中均可检测到病毒核酸，其中脑组织中的病毒载量最高，其次为脾、肝、肺、肾。随着感染时间的延长，各组织器官中的病毒载量在感染后第14天有所下降，但仍维持在一定水平，在感染后第21天，脑组织中仍可检测到较高水平的病毒核酸，其他组织器官中的病毒载量进一步下降。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪在感染后第7天，各组织器官中的病毒载量均显著高于野生型毒株感染组，其中脑组织中的病毒载量增加最为明显。在感染后第14-21天，虽然各组织器官中的病毒载量有所下降，但仍高于野生型毒株感染组，表明rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后，病毒在组织器官中的复制能力更强，感染更为严重。[此处插入不同组织器官中JEV病毒核酸检测结果图]图4-5不同组织器官中JEV病毒核酸检测结果图注：*表示与对照组相比，P<0.05；**表示与对照组相比，P<0.01；#表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.05；##表示与JEVSA14-14-2野生型毒株感染组相比，P<0.014.3组织病变与细胞嗜性4.3.1大脑皮层及丘脑病理学观察对感染JEV的仔猪大脑皮层及丘脑进行病理学观察，结果如图4-6所示。对照组仔猪大脑皮层和丘脑组织结构正常，神经元形态完整，胞核清晰，未见明显的变性、坏死及炎症细胞浸润现象。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第7天，大脑皮层和丘脑出现轻度病变，部分神经元出现肿胀，尼氏体减少，可见少量炎性细胞浸润，主要为淋巴细胞和单核细胞，病变区域主要集中在大脑皮层浅层和丘脑的部分核团。随着感染时间的延长，在感染后第14天，病变加重，神经元变性、坏死明显增多，部分神经元胞体皱缩，胞核固缩、溶解，炎性细胞浸润更加明显，形成小胶质细胞结节，在大脑皮层和丘脑均可见散在的坏死灶。感染后第21天，病变仍较明显，坏死灶周围可见胶质细胞增生，形成胶质瘢痕。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪在感染后第7天，大脑皮层和丘脑病变程度较野生型毒株感染组更为严重，大量神经元出现明显的变性、坏死，尼氏体消失，炎性细胞浸润广泛，可见大量淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润，坏死灶较多且面积较大。在感染后第14天，病变进一步加剧，大脑皮层和丘脑的神经元广泛坏死，炎性细胞浸润极为明显，形成大片的坏死区域，部分区域可见出血现象。感染后第21天，虽然病变有所减轻，但仍可见大量胶质细胞增生，脑组织出现明显的萎缩和软化。[此处插入大脑皮层及丘脑病理学观察的HE染色图片]图4-6大脑皮层及丘脑病理学观察的HE染色图片（400×）A、B、C分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第7天的大脑皮层；D、E、F分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第7天的丘脑；G、H、I分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第14天的大脑皮层；J、K、L分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第14天的丘脑；M、N、O分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第21天的大脑皮层；P、Q、R分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第21天的丘脑4.3.2脑组织免疫组化检测与细胞偏嗜性探究对感染JEV的仔猪脑组织进行免疫组化检测，以探究JEV在脑组织中的细胞偏嗜性，结果如图4-7所示。对照组仔猪脑组织中未见JEV抗原阳性信号，细胞形态正常，无特异性染色。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第7天，在大脑皮层和丘脑的神经元细胞中可检测到少量JEV抗原阳性信号，呈棕黄色颗粒状，主要分布在神经元的细胞质中，表明JEV对神经元细胞具有一定的嗜性。随着感染时间的延长，在感染后第14天，阳性信号逐渐增多，不仅在神经元细胞中，还在部分星形胶质细胞中检测到阳性信号，但仍以神经元细胞中的阳性信号为主。感染后第21天，阳性信号有所减少，但在部分神经元和星形胶质细胞中仍可检测到。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪在感染后第7天，大脑皮层和丘脑的神经元细胞中可见大量JEV抗原阳性信号，阳性信号强度明显高于野生型毒株感染组，同时在部分小胶质细胞中也检测到阳性信号。在感染后第14天，阳性信号进一步增多，广泛分布于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中，且阳性信号强度较强。感染后第21天，虽然阳性信号有所减少，但在多种细胞类型中仍可检测到，表明rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后，JEV在脑组织中的感染范围更广，对多种细胞类型均具有较高的嗜性。[此处插入脑组织免疫组化检测结果图片]图4-7脑组织免疫组化检测结果图片（400×）A、B、C分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第7天的大脑皮层；D、E、F分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第7天的丘脑；G、H、I分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第14天的大脑皮层；J、K、L分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第14天的丘脑；M、N、O分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第21天的大脑皮层；P、Q、R分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第21天的丘脑4.3.3软腭扁桃体免疫组化检测与细胞偏嗜性探究对感染JEV的仔猪软腭扁桃体进行免疫组化检测，以研究JEV在该组织中的细胞嗜性，结果如图4-8所示。对照组仔猪软腭扁桃体组织中未检测到JEV抗原阳性信号，细胞结构正常，无特异性染色。JEVSA14-14-2野生型毒株感染组仔猪在感染后第7天，在软腭扁桃体的部分淋巴细胞和上皮细胞中可检测到少量JEV抗原阳性信号，呈棕黄色颗粒状，主要分布在细胞质中，表明JEV对软腭扁桃体的淋巴细胞和上皮细胞具有一定的嗜性。随着感染时间的延长，在感染后第14天，阳性信号有所增多，在淋巴细胞、上皮细胞和部分巨噬细胞中均能检测到阳性信号，但阳性信号强度相对较弱。感染后第21天，阳性信号有所减少，仅在少数淋巴细胞和上皮细胞中可检测到。rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组仔猪在感染后第7天，软腭扁桃体的淋巴细胞、上皮细胞和巨噬细胞中可见较多JEV抗原阳性信号，阳性信号强度明显高于野生型毒株感染组。在感染后第14天，阳性信号进一步增多，广泛分布于多种细胞类型中，且阳性信号强度较强。感染后第21天，虽然阳性信号有所减少，但仍在较多细胞中可检测到，表明rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后，JEV在软腭扁桃体中的感染更为广泛，对多种细胞类型的嗜性更强。[此处插入软腭扁桃体免疫组化检测结果图片]图4-8软腭扁桃体免疫组化检测结果图片（400×）A、B、C分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第7天的软腭扁桃体；D、E、F分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第14天的软腭扁桃体；G、H、I分别为对照组、JEVSA14-14-2野生型毒株感染组、rJEVSA14-14-2A66G毒株感染组在感染后第21天的软腭扁桃体五、讨论5.1差异表达NS1’蛋白对JEV毒株感染仔猪表型的影响NS1’蛋白作为JEV的重要非结构蛋白，其表达差异对JEV毒株感染仔猪的表型产生了多方面的显著影响。在抗体产生方面，本研究结果表明，rJEVSA14-14-2A66G毒株（高表达NS1’蛋白）感染仔猪后诱导产生的抗体水平明显高于JEVSA14-14-2野生型毒株（低表达NS1’蛋白）感染组。这可能是因为高表达的NS1’蛋白能够更有效地刺激仔猪的免疫系统，促使B淋巴细胞活化和增殖，从而产生更多的特异性抗体。NS1’蛋白可能通过与宿主细胞表面的模式识别受体结合，激活相关的信号通路，促进免疫细胞的活化和抗体的产生。有研究表明，NS1’蛋白可以与Toll样受体4（TLR4）相互作用，激活下游的NF-κB信号通路，进而诱导免疫细胞分泌细胞因子，促进B淋巴细胞的分化和抗体的产生。这一结果提示，NS1’蛋白的表达水平可能是影响JEV感染仔猪体液免疫应答的关键因素之一，高表达的NS1’蛋白有利于增强仔猪对JEV的体液免疫反应，提高机体的抗感染能力。在体温变化和临床症状方面，rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后，体温升高出现时间更早，上升速度更快，峰值更高，且神经症状和呼吸道症状更为严重。这表明NS1’蛋白的高表达可能增强了JEV的毒力，导致仔猪的病情加重。NS1’蛋白可能通过多种机制影响病毒的毒力。它可以调节病毒的复制和传播，高表达的NS1’蛋白可能促进病毒在宿主细胞内的复制，使病毒在短时间内大量增殖，从而导致机体更快地出现病理变化和临床症状。NS1’蛋白还可能影响宿主细胞的功能和代谢，干扰宿主的免疫防御机制，使机体更容易受到病毒的侵害。有研究发现，NS1’蛋白可以抑制宿主细胞的干扰素产生，降低宿主细胞的抗病毒能力，从而使病毒能够在宿主体内更自由地复制和扩散。这一结果说明，NS1’蛋白的表达差异与JEV毒株的毒力密切相关，高表达的NS1’蛋白会加重JEV感染仔猪的病情，对仔猪的健康造成更大的威胁。在病毒在体内的分布和复制方面，rJEVSA14-14-2A66G毒株感染仔猪后，血液、鼻拭子和各组织器官中的病毒载量均显著高于JEVSA14-14-2野生型毒株感染组，且病毒血症持续时间更长，鼻腔排毒量更大、时间更长。这表明NS1’蛋白的高表达能够促进病毒在仔猪体内的复制和传播。NS1’蛋白可能参与了病毒的入侵、装配和释放等过程。在病毒入侵阶段，高表达的NS1’蛋白可能增强病毒与宿主细胞表面受体的结合能力，促进病毒进入细胞。在病毒装配和释放阶段，NS1’蛋白可能协助病毒粒子的组装，使其更高效地从宿主细胞中释放出来，进而感染更多的细胞。有研究表明，NS1’蛋白可以与病毒的结构蛋白相互作用，促进病毒粒子的组装和释放。这一结果进一步证实了NS1’蛋白在JEV感染过程中的重要作用，高表达的NS1’蛋白会加速病毒在仔猪体内的传播和扩散，导致更严重的感染。5.2JEV毒株感染仔猪的组织病变与细胞嗜性机制探讨JEV毒株感染仔猪后，在大脑皮层及丘脑等组织中引发了明显的病理学变化。从实验结果来看，对照组仔猪的大脑皮层和丘脑组织结构正常，而感染JEV的仔猪，尤其是感染rJEVSA14-14-2A66G毒株（高表达NS1’蛋白）的仔猪，病变程度更为严重。这可能是因为高表达的NS1’蛋白增强了病毒的毒力，使得病毒在脑组织中大量复制，导致神经元广泛变性、坏死。NS1’蛋白可能通过抑制宿主细胞的抗病毒防御机制，如干扰干扰素信号通路，使神经元更容易受到病毒的侵害。神经元的损伤会影响神经系统的正常功能，导致仔猪出现抽搐、共济失调等神经症状。炎性细胞浸润也是组织病变的重要表现，大量炎性细胞的聚集会引发炎症反应，进一步加重组织损伤。在细胞嗜性方面，JEV对神经元细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞以及软腭扁桃体中的淋巴细胞、上皮细胞和巨噬细胞等多种细胞类型均具有嗜性。这表明JEV能够感染多种细胞，在不同组织中进行复制和传播。感染rJEVSA14-14-2A66G毒株的仔猪，JEV在脑组织和软腭扁桃体中的感染范围更广，对多种细胞类型的嗜性更强。这可能与高表达的NS1’蛋白增强了病毒与细胞表面受体的结合能力有关。NS1’蛋白可能通过与细胞表面的特定受体相互作用，促进病毒进入细胞，从而扩大了病毒的感染范围。不同细胞类型对JEV的易感性可能与细胞表面受体的表达水平、细胞内的信号通路以及免疫状态等因素有关。神经元细胞可能由于其表面存在特定的JEV受体，且免疫防御能力相对较弱，因此更容易受到感染。而免疫细胞如巨噬细胞和淋巴细胞，虽然具有一定的免疫防御功能，但JEV可能通过某些机制逃避了它们的免疫监视，从而在这些细胞中进行复制。JEV感染仔猪的组织病变和细胞嗜性与病毒的毒力和致病机制密切相关。NS1’蛋白的表达差异在其中起到了关键作用，高表达的NS1’蛋白会加重组织病变，扩大病毒的感染范围，导致更为严重的临床症状。深入研究这些机制，有助于我们更好地理解JEV的致病过程，为开发有效的防控策略提供理论依据。5.3研究结果对猪流行性乙型脑炎防控的启示本研究结果为猪流行性乙型脑炎的防控提供了多方面的重要启示。在疫苗研发方面，鉴于NS1’蛋白表达差异对JEV毒力及感染仔猪表型的显著影响，可将NS1’蛋白作为新型疫苗研发的关键靶点。高表达NS1’蛋白的JEV毒株能够诱导仔猪产生更高水平的抗体，这提示我们可以通过基因工程技术，构建表达特定NS1’蛋白的重组病毒株，以此为基础开发新型疫苗。这种疫苗可能具有更强的免疫原性，能够更有效地激发猪群的免疫反应，提高猪群对JEV的抵抗力。利用基因编辑技术对JEV的NS1’蛋白基因进行修饰，使其表达出具有更好免疫刺激作用的NS1’蛋白，然后将修饰后的病毒株作为疫苗候选株进行研究和开发。在疫苗的免疫策略上，根据本研究中感染仔猪抗体产生的规律，合理调整疫苗的免疫程序。对于高毒力JEV毒株（如高表达NS1’蛋白的毒株）流行区域的猪群，可适当增加疫苗的免疫次数和剂量，以确保猪群能够产生足够的抗体，有效抵御病毒的感染。在仔猪的免疫程序中，可在仔猪3-4周龄时进行首次免疫，间隔3-4周后进行二次免疫，在乙脑流行季节前再加强免疫一次，以提高仔猪的免疫力。在监测措施方面，本研究中病毒血症和鼻拭子病毒检测结果表明，病毒在仔猪体内的排毒时间较长，且不同毒株的排毒情况存在差异。因此，在猪乙脑的监测中，应采用多种检测方法相结合的方式，除了检测血清中的抗体水平外，还应定期检测猪群的血液和鼻拭子中的病毒核酸，及时发现感染猪只，防止病毒的传播扩散。加强对猪群的日常监测，尤其是在乙脑流行季