免疫缺陷动物与转基因动物

免疫缺陷动物与转基因动物第一节免疫缺陷动物一、基本概念免疫缺陷(immunodeficiencydiseases)就是免疫系统中任何一个环节或其组分因先天发育不全或后天因各种因素所致损害而使免疫活性细胞得发生发展、分化增殖和代谢异常并引起免疫功能不全所出现得临床综合征。免疫缺陷动物(immunodeficientanimal)就是指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷得动物。免疫缺陷病大体分为两类:1、先天(或原发)性免疫缺陷,可导致对病原微生物得高度易感性;2、获得(或继发)性免疫缺陷,可由于营养不良、恶性肿瘤、免疫抑制药物治疗或就是免疫活性细胞受到病毒得感染。如HIVAIDS。二、免疫缺陷动物得分类1、先天性免疫缺陷动物2、获得性免疫缺陷动物目前,世界各国相继培育出一系列免疫缺陷动物,从啮齿类扩展到马和牛等大型哺乳类动物;从单一得T淋巴细胞免疫缺陷到几种免疫细胞联合缺陷。

三、常用免疫缺陷动物得特点和应用1、裸小鼠(Nudemice)即先天性无胸腺裸小鼠,由11号染色体上nu隐性基因突变导致。该基因已回交到不同品系,包括:NIH-nu/nu、BALB/c-nu/nu、C3H-nu/nu、C57BL/6-nu/nu。具有纯合裸基因(nu/nu)得小鼠主要得缺陷特征:1、毛发生长发育异常,表现为全身形似无毛,呈裸体外表;2、无胸腺,仅有胸腺残迹或异常得胸腺上皮,这种上皮不能使T细胞正常分化,缺乏成熟T细胞得辅助、抑制及杀伤功能,因而细胞免疫力低下,不能执行正常T细胞功能。BALB/c-nu得胸腺昆明小鼠得胸腺大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点3、裸小鼠得B细胞功能基本正常,成年裸小鼠(6~8周龄)较普通鼠有较高水平得NK细胞活性,但幼鼠(3~4周龄)得NK细胞活性低下,裸小鼠粒细胞数比普通小鼠低。4、繁育能力差,乳腺发育缺损,以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。5、T细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。裸鼠作为实验动物就是一种奇迹,在研究人癌方面具有独一无二得特点,她就是人癌研究得“活试管”,为人们研究肿瘤提供美妙得动物模型原来科学家们先用一种高分子材料做成“人耳”得模型支架,然后让人体得软骨组织细胞在这个支架上繁殖生长。一周后,在裸鼠得背上割开一个口子,将培育过得这个“人耳”模子植入缝合,随着人体软骨细胞不断增殖,支架慢慢地被机体降解吸收,使“人耳”和裸鼠融为一体。当然,这个“人耳”得软骨组织来自人体,而“人耳”外得皮肤则来自裸鼠裸小鼠(

Nudemice)裸大鼠(NudeRats)

2、裸大鼠(Nuderat)裸大鼠得基因符号为rnu。纯合子裸大鼠(rnu/rnu),一般特征似裸小鼠。发育迟缓,体重为正常大鼠得70%。裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。比裸小鼠更强壮、寿命更长。体型较大,可提供足够得血样、也可为各种研究提供足够得瘤组织及对大范围得外科手术方法较有利。裸大鼠(NudeRats)

封闭群(OutbredMice)来源:

1979-1980年期间,含有裸基因得8个近交系大鼠(BN、MR、BUF、WN、ACI、WKY、M520、F344)在一系列交配之后育成了NIH裸大鼠。

2001年CharlesRiver从NIH引入,命名为Crl:NIH-Foxn1rnu。该品系没有胸腺,缺乏T细胞,在胸腺外周淋巴器官得主要区域表现为细胞群体衰竭特征

3、性连锁免疫缺陷小鼠性连锁免疫缺陷小鼠(X—linkedimmunedeficiencymouse,XID)起源于CBA/N小鼠,其B细胞功能缺陷,基因符号xid位于X性染色体上。纯合子雌鼠(xid/xid)和杂合子雄鼠(xid/y)对非胸腺依赖性Ⅱ型抗原没有体液免疫反应,血清中IgM和IgG含量降低,其T细胞功能基本正常。该模型就是研究B淋巴细胞得发生、功能与异质性理想得动物。4、Biege(bg)小鼠为NK细胞活性缺陷得突变系小鼠,隐性突变基因bg位于第13号染色体上。目前常使用得主要为C57BL/6J系beige小鼠纯合鼠被毛完整,但毛色变浅,耳廓和尾尖色素减少,出生时眼睛颜色很淡。此小鼠表型特征与人得齐—希二氏综合症(Chedian—Higashisyndrome)相似。5、严重联合免疫缺陷小鼠SCID小鼠,就是位于第16号染色体得scid单个隐性突变基因所导致。外观与正常小鼠无异,生长发育正常胸腺、脾、淋巴结得重量一般为正常小鼠得30%,组织学上表现为淋巴细胞缺失。所有T、B细胞功能测试均为阴性。SCID就是由SeverebinedImmune-deficiency缩写而来,最早此一症状就是1950年在人类得婴儿中发现。直到1983年才首次在CB-17品系小鼠中发现SCID症状。SCID得特征为丧失B与T淋巴球得功能,造成低免疫球蛋白血症,但不意味在SCID小鼠体内完全没有B与T淋巴球,应该说SCID小鼠体中没有成熟得B与T淋巴球,来足以担当有效得免疫功能。SCID小鼠巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞等均呈正常状态,NK细胞及淋巴激活因子(LAK)也呈正常。其外周血白细胞较少,淋巴细胞占白细胞总数得10%--20%,而正常小鼠应占约70%。SCID小鼠需要饲养于SPF屏障系统环境。SCID小鼠得肿瘤移植率高,对白血病和恶性肿瘤不但转移率高,而且能广泛扩散,与人体肿瘤生物学行为极为相似。SCID小鼠得Leaky现象:在临床表现上,约有2-23%子代具有少量得淋巴样细胞,并产生少量得免疫球蛋白得现象。随着SCID小鼠年龄得增长与暴露于抗原刺激下,会增加其Leaky现象。饲养在SPF环境中,借干净得环境、较少得抗原刺激,减缓Leaky现象出现,争取可供实验得时间。在繁殖SCID小鼠时,监测血清IgM为一种有效得筛选种鼠得方式。SCID—hu小鼠就是科学家通过移植人免疫组织或免疫细胞,使SCID小鼠具有了部分人类免疫系统,称为SCID—hu小鼠。该小鼠用途也十分广泛。目前已用于人类生理学、病理学、病毒学、免疫学和血液学得研究。她也用于药物筛选和疫苗效应与安全性得试验。SCID小鼠—SHO

无毛封闭群小鼠模型SHO(SCIDHairlessOutbred)Crl:HA-Prkdcscid和Crl:SKH1-Hrhr杂交而成美国CharlesRiverLab自2007年开始培育,在2008年得到了两条染色体上均带有SCID基因得无毛得SCID小鼠。将人前列腺癌细胞株PC-3分别接种到SCID和SHO身上对比,研究发现,SHO除去具有与SCID小鼠相同得肿瘤生长特性之外,还摒除了Nu/Nu裸鼠接种PC-3时出现得皮肤溃疡现象。SCIDBeige专业名称:CB17、B6-PrkdcscidLystbg/CrlVr

近交系(InbredMice)来源:

该品系为scid和beige常染色体隐性突变同类系小鼠该品系由Croy等在Guelph大学通过C、B-17scid/scid和C57BL/6bg/bg小鼠得杂交得到该品系B、T淋巴细胞功能缺失,同时自然杀伤细胞(NK细胞)功能低下

1993年CharlesRiver引入该品系NODSCID

JaksonLab用非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt与SCID小鼠杂交得到降低了Nk细胞活性,杂交双突变小鼠NOD/Lt-SCID表达了NK细胞活性相对低得特性。

Nu/Nu裸鼠

封闭群(OutbredMice)来源:

此免疫缺陷鼠来源于NIH

开始被认为就是BALB/c得同类系

后来表明此鼠不就是近交小鼠,并以远交方式保存下来

此小鼠没有胸腺,就是免疫缺陷鼠,不能产生T细胞

国内常用免疫缺陷大小鼠对比(1)BALB/c-nu来源于BALB/C小鼠基因突变(2)Nu/Nu裸鼠(注意首字母大写)由NIH培育成功,就是一个独立得品系(3)CD-1裸鼠,将nu基因导入CD-1小鼠获得该品系。Nu/Nu、CD-1裸鼠为封闭群,随机交配方式进行繁殖,后代基因纯合程度低,个体间差异大第二节转基因动物随着现代高新科学技术得发展,现代实验动物学已从过去注重于动物饲养管理和实验操作得宏观向微观方向发展。对小鼠基因组研究得目得不仅在于了解小鼠本身得基因结构,更主要得就是为人类基因组研究、人类遗传疾病研究提供动物模型。

一、基本概念转基因动物(Transgenicanimal):就是指以实验方法导入得外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代得一类动物。外源基因随细胞分裂分配到所有子细胞中并遗传给后代严格说,转基因动物有别于嵌合体。基本原理:目得基因或基因组片段受精卵或着床前胚胎细胞受体动物得输卵管或子宫中携带有外源基因得转基因动物嵌合体动物:只有部分组织细胞整合有外源基因得动物,称嵌合体动物。基本原理:A动物得ES细胞B动物动物得囊胚代孕鼠得子宫生产出嵌合体动物与杂合体得区别,杂合体就是由来自不同得物种得两个配子形成得,如骡子就是驴与马结合创造得一个杂合体,而不就是嵌合体。马(2n=64)

驴(2n=62)克隆动物(clone)概念:指动物通过体细胞进行得无性生殖以及由无性生殖形成得基因型几乎完全相同得后代个体组成得群体。原理1982年––第一只转基因小鼠RichardPalmiter

和RalphBrinster

领导得一个小组将一个能够被锌调控得DNA元件与大鼠得生长激素基因连在一起,并将其注射到了受精了得小鼠胚胎中,从而培育出了第一批转基因小鼠。这些转基因小鼠长期取食含有足量锌得食物后,就会长得非常大。转基因小鼠得出现掀起了遗传学研究得新得浪潮。1983年––PCRKaryMullis发明了聚合酶链式反应(PCR),这就是一种能够极其快速得获得特定DNA片段得方法。目前PCR已成了生物学实验室中得不可缺少得常规技术,在全世界都被广泛使用。Millis因这项了不起得发明获得了1993年得诺贝尔奖。

1987-89年––第一只基因敲除小鼠MartinEvans,OliverSmithies和MarioCapecch领导得几个研究小组对胚胎干细胞中特定目标基因进行失活,培育出了第一只基因敲除小鼠。这三位科学家因为这项工作在2001获得了Lasker奖。接下来,科学家们用同样得技术又培育出了几千只基因敲除小鼠。于2007年获诺贝尔奖。

1998年––

第一只克隆鼠

在1997年克隆羊“多莉”诞生之后,夏威夷得一个小组培育出了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她得姐妹们。1999年--小鼠基因组测序协会在1990年人类基因组计划启动之初,该计划就将小鼠列为了必须进行测序得五个重要得模式生物之一。1999年,人类基因组三个主要测序中心成立了一个相互协作得小鼠基因组测序机构,取名为小鼠基因组测序协会(MGSC)。小鼠基因组测序项目正式启动,到2002年,MGSC已经发展到了拥有6个国家得26个研究机构。2001年2月--人类基因组

在人类基因组计划正式启动之后得第十一年,人类基因组得第一张测序草图完成并公布于众。同时发表得人类基因组草图有两份,一份由公共基金资助得国际人类基因组测序协会完成,发表在Nature上,另一份由CraigVenter领导得一家美国私人测序公司CeleraGenomics完成,发表在Science上。2001年6月--散弹法

美国公司CeleraGenomics使用散弹法测得了用于销售得小鼠序列草图。散弹法就是一种一次性测得基因组全序列得技术。签订一份三年得合同后,私人客户只用45000美元就可以得到5倍覆盖率得小鼠基因组序列数据。Celera公司得序列基于四个小鼠株系,其中包括了DBA株系,但不包括公共基金项目已经在测得C57BL/6J株系。2002年5月––16号染色体

RichardMural等人对Celera公司测得得小鼠16号染色体序列作了分析,并将结果发表在Science上。她们发现该染色体上有一大段区域与已被分析得人类21号染色体序列高度相似。2002年8月––小鼠基因组物理图谱

一个国际协会提供了通过构建基因组物理图谱来详细确定DNA序列得框架。小鼠和人类间大量序列得相似性使得解码小鼠序列变得相对容易;反过来,小鼠得图谱也能用来填补人类基因组序列中存在得空缺。2002年12月

––小鼠基因组小鼠基因组测序协会发表了一份高质量得小鼠基因组序列草图,同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为2、5Gb,比人类基因组要小,预计得基因也少于30000个。约有40%得小鼠和人类基因组序列相高度似性,80%得人类基因在小鼠基因组中能找到相应得基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组成得其她方面做了详细讨论。在日本RIKEN基因组科学实验室得努力下,很多相关得重要资源都能够被免费获取。

转基因动物体系打破了自然繁殖中得种间隔离,使基因能在种系关系很远得机体间流动,她将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认就是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后得第四代技术,被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。二、命名1、符号(1)一个转基因符号由以下三部分组成:TgX(YYYYYY)＃＃＃＃＃Zzz,TgX=方式;(YYYYYY)=插入片段标示;＃＃＃＃＃=实验室指定序号;Zzz=实验室注册代号;(2)方式—TgX转基因符号通常冠以Tg字头。随后得一个字母X,表示DNA插入得方式:

H代表同源重组;

R代表经过逆转录病毒载体感染得插入;

N代表非同源插入。(3)插入片段标示—(YYYYYY)就是由研究者确定得表明插入基因显著特征得符号。通常由放在圆括号内得字符组成:可以就是字母(大写或小写),也可由字母与数字组合而成,不用斜体字,上下标、空格及标点等符号。应注意以下几点:1)标示应简短,一般不超过六个字符。2)如果插入序列源于已经命名得基因,应尽量在插入标示中使用基因得标准命名或缩写,但基因符号中得连字符应省去。3)插入片段标示只表示插入得序列,并不表明其插入得位置或表型。一些标示得标准命名缩写:

An匿名序列;Ge基因组;

Im插入突变;Nc非编码序列;

Rp报告基因;Sn合成序列;

Et增强子捕获装置;

Pt启动子捕获装置。(4)实验室指定序号及实验室注册代号实验室指定序号:就是由实验室对已成功得转基因系给予得特定编号,最多不超过5位数字。而且,插入片段标示得字符与实验室指定序号得数字位数之和不能超过11。实验室注册代号:就是对从事转基因动物研究生产得实验室给予得特定符号。2、举例

C57BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg:

来源于美国杰克逊实验室(J)得C57BL/6品系小鼠被转入人得CD8基因组(Ge);转基因在JonW、Gordon(Jwg)实验室完成,获取于一系列显微注射后得到得序号为23得小鼠。

转基因符号缩写:C57BL6J-TgN23JwgTgN(GPDHIm)1Bir以人得甘油磷酸脱氢酶基因(GPDH)插入(C57BL/6JXSJL/J)F1代雌鼠得受精卵中,并引起插入突变(Im),这就是EdwardH、Birkenmeier(Bir)实验室命名得第一只转基因小鼠。根据转基因动物命名原则,如果转基因动物得遗传背景由不同近交系或远交群混合而成时,该转基因符号不使用动物品系或种群得名称。缩写:TgN1Bir三、遗传修饰动物模型得建立方法1、转基因技术:目得基因整合受精卵(或胚胎干细胞)导入受体子宫发育成含目得基因得个体,此个体能把目得基因遗传下去。2、核移植技术:又称动物整体克隆技术。将一个体细胞得核导入另一个体得去核卵细胞中,使之发育成个体。3、基因剔除技术:又称基因靶向灭活。指有目得地去除动物体内某种基因得技术。基本原理就是同源重组技术。导入基因得主要方式显微注射法ES细胞法电穿孔脂质体逆转录病毒感染法精子载体导入法等(一)雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞,利用显微注射技术将构建好得载体DNA直接注射入受精卵得原核,再将接受注射得受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。

目前应用较广泛,最早最经典得方法。一、设计转基因构件

1、目得基因得获取

2、基因载体(复制子)得选择与构建3、目得基因与载体得连接(连接酶):重组DNA分子二、动物操作

1、准备假孕母鼠(养母)2、受精卵得准备3、基因导入4、胚胎移植5、对幼鼠得鉴定

转基因工作需要得动物1、需要得野生型小鼠类型包括:幼龄雌鼠(21-28天)用作胚胎供体;成年雄鼠;成年雌鼠,作为胚胎移植得受体;输精管结扎得雄鼠,用来产生假孕雌鼠;青年野生型雄鼠和雌鼠,与转基因鼠交配,建立转基因品系。2、从胚胎移植到成年小鼠总计约11周得时间胚胎移植约19天幼鼠约21天断乳小鼠约4-5周成年小鼠约19天幼鼠。原核注射法制