奇异变形杆菌的分离鉴定及耐药性分析

前言奇异变形杆菌是自然界一种常见的条件致病菌，属于肠杆菌科、变形杆菌属，无芽孢和荚膜,形态为两端钝圆的短杆状，革兰氏染色呈现阴性并且在培养基上会出现蔓延扩散现象。该菌是一种人畜共患病原菌，具有一定的污染性，可以通过感染动物制品进而感染人类，容易引发中毒。奇异变形杆菌在自然环境中分布广泛，多见于水、污水和土壤中REF_Ref8613\r\h[1]，有着细胞迁徙和独特的蜂群活动等生物学特性。奇异变形杆菌在微生物的有机物分解中起着至关重要的作用，被认为是粪便的主要成分REF_Ref12650\r\h[2]，较多出现在人和动物的粪便或肠道中，通常经消化道、呼吸道等方式侵入宿主体内，宿主机体被感染会出现伤口感染、腹泻、尿路感染等症状，免疫力低下者甚至会引起更为严重的病症，例如败血症、脑膜炎、肺炎等疾病。奇异变形杆菌可感染猪、牛、狐狸REF_Ref8728\r\h、犬、梅花鹿、家禽等REF_Ref8698\r\h[3-REF_Ref12813\r\h7]多种动物，其致病力主要与其高粘附性的菌毛、丰富的鞭毛、荚膜多糖以及蛋白水解酶等因子相关REF_Ref12650\r\h[2]，且由于其独特的蜂群行为和快速协调的多细胞活性导致感染奇异变形杆菌的症状严重并且难以治疗，影响广泛。奇异变形杆菌由于其耐药性强、传播速度快、易感动物种类多等特点，近年来由其引发的动物疾病越来越多，一直备受关注，而如今对于防治该菌临床上依旧缺少特效药，不仅增加了这类疾病的防治难度，还危害着我国的公共卫生安全，同时也给我国畜禽养殖业造成了极大的损失。本研究采集病死鸭的肾脏进行细菌的分离纯化培养，对分离得到的分离菌进行染色、生化试验等一系列操作，观察其形态特征以及反应变化，并开展药敏试验与耐药性对比试验进一步分析。为防控奇异变型杆菌所致疾病提供了理论依据，为临床诊治相关疾病奠定了基础。1材料与方法1.1材料1.1.1病料病料来自于河南某养殖场病鸭肾脏。1.1.2主要试剂及仪器普通营养琼脂培养基（NA），强选择性培养基（SS），麦康凯琼脂培养基（MAC），血琼脂培养基，三糖铁试管培养基，BP培养基，亚硫酸铋琼脂培养基（BS），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD），伊红美蓝培养基（EMB），革兰氏染色液，瑞氏染色液，细菌微量生化反应管，抗菌素药敏片，甘油，电子天平，普通光学显微镜，高压锅，恒温培养箱，摇床。1.2试验方法1.2.1细菌的分离培养将无菌采集的肾脏组织在无菌操作台上涂抹接种于NA培养基，于37℃恒温培养箱培养24h后观察菌落形态；取单菌落接种于NA培养基进行第二次纯培养；取单菌落在无菌操作下分别接种于SS培养基、血琼脂培养基、麦康凯培养基、BP培养基、BS培养基、XLD培养基、EMB培养基进行培养，放入37℃培养箱培养24h后观察菌落形态及生长状况。1.2.2涂片染色镜检观察选取分离菌单菌落用接种环均匀涂抹在滴有生理盐水的载玻片上，制作两个玻片，来回移动载玻片在酒精灯外焰处烤干，然后将两个玻片分别用革兰氏染液和瑞氏染液进行染色，用显微镜观察菌落形态特征。1.2.3生化试验在无菌条件下取分离菌单菌落，用接种环分别接种到葡萄糖、乳糖、蔗糖、靛基质、尿素、ONPG、麦芽糖、赖氨酸脱羧酶的生化鉴定玻璃管中，观察管中的反应情况以及颜色变化，对分离菌进行生化鉴定。三糖铁试验：用掰直的接种环取已分离纯化的单菌落，垂直过半插入三糖铁试管培养基的斜面中然后拔出，密封放入37℃培养箱培养后观察试管内情况。1.2.4药敏试验在无菌环境下取分离纯化的单菌落用接种环密集均匀划线于NA培养基，用杀菌后的镊子将28种不同药敏片分四组按一定间隔分别放在四个NA培养基上，放入37℃培养箱进行培养。培养24h后观察结果并测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径判定分离菌对药物的敏感性。1.2.5耐药菌对照试验分为试验组和对照组，试验组在无菌条件下取药物抑菌圈内接近头孢氨苄药片生长的单菌落在NA培养基上进行密集划线，然后取两枚该药片间隔放置于培养基上；对照组取原本已经分离培养过的单菌落在NA培养基上进行密集划线，后取两枚头孢氨苄药片放置于培养基上，将两个培养基都放入37℃培养箱进行培养，然后对比观察抑菌圈直径大小。1.2.6耐药菌纯培养在无菌条件下取耐药菌对照试验中试验组靠近药片生长的单菌落在NA培养基上做纯培养，得到耐药菌培养皿。2结果与分析2.1细菌的分离培养分离菌在NA培养基上生长状况良好，并且表现出明显的迁徙现象，菌株在NA培养基上出现了蔓延扩散的白色波纹状薄膜，几乎布满整个培养基平面，每一个单菌落周围都有一个浅白的“包围圈”（见图1）；在血琼脂培养基上菌落呈白色，存在迁徙生长现象，生长状态良好（见图2）；在SS培养基上，形成边缘黑色、略透明，中间淡黄色的菌落（见图3）；在麦康凯培养基上呈迁徙蔓延状圆形、半透明状的菌落（见图4）；在XLD和BS培养基上均有少量白色菌落生长，但菌落比较细小，生长状态不佳（见图5、6）；在EMP平板上划线区有黑色物质析出，略有金属光泽（见图7）；BP培养基上几乎没有菌落生长，但有少量黑色物质（见图8）。图1NA培养结果图2血琼脂培养结果图3SS培养结果图4麦康凯培养结果图5XLD培养结果图6BS培养结果图7EMB培养结果图8BP培养结果2.2涂片染色镜检观察经革兰氏染色后的涂片在油镜下（10×100）可见菌落形态为两端钝圆的短杆状，多单个存在，少数成对或短链状排列，菌体着色为淡红色（见图9）；经瑞氏染色后的涂片在油镜下（10×100）可见菌落形态为短小的小杆菌状，部分呈短链状排列，菌体着色为蓝紫色（见图10）。图9革兰氏染色镜检结果图10瑞士染色镜检结果2.3生化试验结果对分离菌进行了生化反应鉴定，其中葡萄糖、乳糖、尿素、ONPG、赖氨酸脱羧酶呈阳性；蔗糖、麦芽糖、靛基质呈阴性，具体试验结果见表1。表1生化试验结果项目结果葡萄糖＋乳糖＋蔗糖—麦芽糖—靛基质—尿素＋ONPG＋赖氨酸脱羧酶＋注：＋阳性；—阴性三糖铁试验结果试管中呈现橘黄色，有菌种生长，生长状态良好，中间产生气柱断层，并且试管壁上也有气泡，说明该菌能够产生气体；试管底部有黑色物质析出，说明该菌能够分解含硫氨基酸，产生黑色的硫化亚铁沉淀（见图11）。图11三糖铁试验结果注：左边为阳性试验组，右边为阴性对照组综上所述，结合序列测定结果，判定该分离菌为奇异变形杆菌。2.4药敏试验结果根据抑菌圈大小判断，在测定的28种药物里面，其中分离菌株对氧氟沙星、头孢他啶、新霉素、米诺环素、环丙沙星、头孢曲松、庆大霉素、诺氟沙星、头孢氨苄、头孢哌酮、丁胺卡那、多西环素、多粘菌素、四环素这14种药物较为敏感，对剩余16种药物有耐药性（结果见表2）。其中试验发现在头孢氨苄的抑菌圈内发现了该菌生长后的菌落（见图12）。表2药品筛选结果药品名称抑菌圈直径（mm）药品名称抑菌圈直径（mm）克林霉素——头孢他啶16头孢唑啉——麦迪霉素——红霉素——氧氟沙星32氨苄西林——多西环素15苯唑西林——新霉素16复方新诺——头孢拉定——多粘菌素15环丙沙星23哌拉西林——头孢曲松21青霉素——庆大霉素18米诺环素22万古霉素——复方新诺——四环素10卡那霉素——头孢哌酮21克林霉素——头孢他啶16头孢唑啉——麦迪霉素——图12头孢氨苄抑菌圈内菌落生长情况2.5耐药菌对照试验结果对照组两个药敏片周围均出现了抑菌圈，可以看出头孢氨苄这种药对于原本的分离菌有明显抑菌效果（见图13）；试验组两个药敏片周围均没有抑菌圈，证明此培养基上的菌落就是头孢氨苄的耐药菌（见图14）。图13对照组分离菌培养结果图14试验组耐药菌培养结果2.6耐药菌纯培养试验结果菌落生长状态良好，菌种形态为圆形白色、培养基内依旧有蔓延扩散的白色波纹状薄膜，可以看出耐药菌也有扩散现象出现，形态与分离菌形态基本一致（见图15）。图15耐药菌纯培养结果3讨论奇异变形杆菌是一种革兰氏染色阴性，无荚膜和芽孢的人畜共患条件性致病菌REF_Ref8290\r\h，形态为两头钝圆的短杆状，属于肠杆菌科、变形杆菌属REF_Ref17110\r\h[8]。分布广泛，能在多种自然界环境中存活，该菌主要有内源性和外源性两种感染方式,内源性感染主要是由于机体抵抗力下降，体内的奇异变形杆菌大量繁殖导致发病；外源性感染主要是来自外界环境中的病原微生物通过各种途径侵入机体从而感染宿主REF_Ref17176\r\h[9]。奇异变形杆菌通常经消化道、呼吸道等方式侵入宿主体内，有较强的致病性，易感动物种类繁多REF_Ref12401\r\h[10]。奇异变形杆菌在临床表现上主要有以下三个类型：急性肠胃炎型、组胺中毒过敏型和急性肠胃炎组胺中毒过敏型混合感染型REF_Ref24945\r\h[11]，近年来关于动物感染奇异变形杆菌的报道越来越多，可以看出在各大养殖场中由奇异变形杆菌所致的疾病普遍存在,给养殖场造成了巨大的经济损失，应当引起临床工作者的重视并加强对该菌的进一步研究。耐药和多重耐药细菌的出现已经成为临床上影响疾病诊治的一大阻碍REF_Ref17715\r\h[12]。群集迁徙运动是细菌运动的最快形式，能够为细菌提供生态学优势，有助于细菌远离抗菌剂以及躲避机体免疫系统REF_Ref10609\r\h[13-REF_Ref11350\r\h14],使细菌产生耐药性，因此具有群集迁徙运动的细菌会具备更强的耐药性。本试验研究发现奇异变形杆菌在不同培养基上均表现出明显的迁移行为，形态上出现了典型的波纹样白色薄膜现象。对于其耐药性，已有多项研究对其进行了报道：但蕊桐等人对五株牛源奇异变形杆菌进行了分离鉴定发现五株菌对临床常见的大部分抗生素都表现出耐药性REF_Ref8698\r\h[3]；王道宁等人从犬腹泻粪便样本中分离得到的十二株奇异变形杆菌，经验测全部具有多重耐药性REF_Ref17986\r\h[6]；曹润来等人对梅花鹿源奇异变形杆菌进行分离鉴定得到的三株菌均显示出很强的耐药性REF_Ref18152\r\h[4]，并且由于奇异变形杆菌具有Ｒ质粒，能够在不同种或属之间转移形成交叉感染，故其耐药性不断增加，引发的疾病治疗难度也在不断增大。上述研究与本研究发现的奇异变形杆菌耐药性结果存在相似性。本研究分离菌的药敏检测结果显示，该菌株对14种临床常用抗菌药物（头孢氨苄、克林霉素、头孢唑啉、红霉素、氨苄西林、笨唑西林、麦迪霉素、复方新诺、哌拉西林、青霉素、头孢他啶、万古霉素、卡那霉素、羧苄西林）呈现多重耐药性，甚至在头孢氨苄药物的抑菌圈内仍有大量菌落生长，可见奇异变形杆菌不仅有很强的耐药性，还能够在生长中发生变异，对某种药物产生抵抗作用而让敏感转为耐药REF_Ref11451\r\h[15]。研究可为临床用药提供可靠的理论指导,减少多重耐药菌株的产生，为临床诊治相关疾病奠定基础。目前临床上还没有有效控制该菌的药物。从鸡鸭这类家禽中分离出的奇异变形杆菌说明该菌可感染动物源产品，通过食物链进行传播。养殖场内应加强饲养管理，保持良好的卫生，定期清理养殖场内粪便，完善消毒工作，防止饲养密度过大，减少细菌繁殖的机会，也要减少养殖场抗生素的滥用REF_Ref8290\r\h[16]。相关部门要加强对奇异变形杆菌病的研究，从而采取有效的措施来控制耐药奇异变形杆菌的传播。奇异变形杆菌虽在自然界中广泛存在,但若做好防护依旧可以减少感染出现。4结论本试验系统研究了从病鸭肾脏所分离的1株奇异变形杆菌的形态特征和耐药特征，发现该菌形态为两端钝圆短小的短杆状，存在着明显的群集迁移运动并且对β-内酰胺类（青霉素、氨苄西林、头孢氨苄等）、四环素类（四环素）和氨基糖苷类（庆大霉素、卡那霉素等）等抗生素具有多重耐药性。本研究为奇异变形杆菌防控奠定了基础。

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