基因工程的基本操作程序第1课时课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第2节

基因工程的基本操作程序第一课时人教版

选择性必修31997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?苏云金杆菌普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定Bt基因在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)通过产生苏云金杆菌伴孢品体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。这个“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉用到的目的基因--Br抗虫蛋白基因，简称Br基因。1、什么是目的基因？目的基因的筛选与获取知识拓展——基因的结构（1）基因的结构放大DNA片段能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段基因1基因2基因3与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA启动子终止子本质：位置：作用：是一段有特殊序列结构的DNA片段位于基因上游也是一段有特殊序列结构的DNA片段位于基因下游终止转录本质：位置：作用：启动子终止子非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游（2）原核细胞的基因结构连续的、不间隔的（3）真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区间隔的、不连续的外显子：内含子：能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的序列能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的序列外显子内含子启动子终止子2、那么如何筛选目的基因呢？浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程用苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？当B抗虫蛋白被分解为多肤后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bl抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，B抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。随着测序技术的发展，以及遗传序列数据库(如GenBank)、序列比对工具(如BLAST)等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。3、明确目的基因后该怎么获得它呢？目的基因获取方法从基因文库中获取人工合成目的基因利用PCR获取和扩增目的基因基因组文库部分基因文库（cDNA文库）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的

群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称

为基因文库。（1）从基因文库中直接获取将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存提取某种生物的全部DNA多个一定大小的DNA片段基因表达载体用适当的限制酶切割基因组文库a.基因组文库的构建b.部分基因文库（如cDNA文库）构建提取某种生物某器官或特定发育时期的mRNA单链互补DNA双链DNA片段基因表达载体与载体连接cDNA文库逆转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存mRNA逆转录酶RNA-DNA杂交双链单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌中储存文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以（2）人工合成目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成反转录法：根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成①前提：②方法：DNA合成仪基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1988年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。（3）利用PCR获取和扩增目的基因旧知回顾模板：原料：能量：酶：DNA的两条母链4种游离的脱氧核苷酸③复制特点:①边解旋边复制

碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）①条件②复制原则:ATP②半保留复制DNA聚合酶（形成磷酸二酯键）解旋酶（解螺旋，打开氢键）④子链的延伸方向：5'端→3'端引物：使DNA聚合酶能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸DNA聚合酶特点1：只能5'端→3'端①体外DNA复制所需的基本条件耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸(dNTP)dATPdGTPdCTPdTTP真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分

反应还需要其它条件：解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常与两条模板链结合的2种短的单链DNA）如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）打开DNA双链，破坏氢键提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸功能：①提供原料；②提供能量②扩增的过程：3’5’3’5’3’5’3’5’A.变性

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链B.复性（退火）当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合C.延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’变性复性延伸③扩增的结果：扩增次数1次2次3次4次n次DNA总数212223242n长链-中长链DNA中长链-短链DNA短链-短链DNA含引物A(或B)的DNA20022240226822(n-1)2n-2n137152n-1细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化边解旋边复制场所主要在细胞核内酶解旋酶、DNA聚合酶等温度细胞内温和条件结果合成整个DNA分子联系①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端合成子链DNA在高温下变性解旋全部解旋后再复制细胞外(主要在PCR扩增仪内)耐高温的DNA聚合酶控制温度，需在不同温度下进行扩增特定的DNA片段或基因②扩增产物的鉴定：DNA片段的扩增及电泳鉴定利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。目的要求1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定

PCR的产物。材料用具PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置(包括电泳仪、电泳槽等)、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。方法步骤1.用微量移液器按照右栏中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。2.待所有的组分都加人后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在管的底部。3.参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。4.根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为0.8%~1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒人模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。7.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。8.将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注人凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入分子大小的标准参照物。9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。10.取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。注意1.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。结果分析与评价1.你是否成功扩增出DNA片段?判断的依据是什么?2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。①如果扩增不成功，可能的原因有：