粉防己碱长循环脂质体的制备及体外抗肺癌作用的研究

粉防己碱长循环脂质体的制备及体外抗肺癌作用的研究摘要：目的制备粉防己碱长循环脂质体，并探讨其对肺癌细胞的抑制作用。方法乙醇注入法制备粉防己碱长循环脂质体并优化，进行表征研究；平衡透析法考察体外释药特性，肉眼观察法和分光光度法考察体外溶血情况，MTT法评价其对A549细胞增殖抑制效果。结果乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法制备粉防己碱长循环脂质体的包封率较高，粒径与电位较小，稳定性较佳；制备平行样品，包封率为（80.13±6.60）%，粒径为51.79±1.24nm，PDI为0.17±0.02，Zeta电位为-0.37±0.34mV。形态呈圆形或类圆形。10天内稳定性较好；样品的体外释药平稳、缓释，无溶血情况，对A549细胞有明显的抑制效果。结论制得的粉防己碱长循环脂质体具有体外缓释效果、溶血作用低，且体外抑制肺癌效果明显。关键词：粉防己碱；长循环脂质体；肺癌；体外溶血PreparationofTetrandrinelong-circulatingliposomesanditsanti-lungcancereffectinvitroAbstract:ObjectiveTopreparetetrandrinelong-circulatingliposomesandinvestigateitsinhibitoryeffectonlungcancercells.MethodsTetrandrinelongcirculationliposomeswerepreparedbyethanolinjectionandoptimizedforcharacterization,thereleasecharacteristicsoftetrandrineinvitrowereinvestigatedbyequilibriumdialysis,hemolysisinvitrowasobservedbynakedeyeobservationandspectrophotometry,anditsinhibitoryeffectontheproliferationofA549cellswasevaluatedbyMTTmethod.ResultsTetrandrinelongcirculationliposomespreparedbyethanolinjectioncombinedwithDSPE-PEG2000insertionmethodhadhigherentrapmentefficiency,smallerparticlesizeandpotentialandbetterstability,whileparallelsampleswereprepared,theentrapmentefficiencywas(80.13±6.60)%,theparticlesizewas51.79±1.24nm,andtheZetapotentialwas-0.37±0.34mV.Theshapeisroundorquasi-circular.Itwasstablewithin10days.Tetrandrinelong-circulatingliposomewasstableandslowinvitro,hadnohemolysis,andhadobviousinhibitoryeffectonA549cells.ConclusionTetrandrinelong-circulatingliposomehastheeffectofsustainedreleaseinvitro,lowhemolysisandobviousinhibitoryeffectonlungcancerinvitro.Keywords:tetrandrine;long-circulatingliposome;lungcancer;invitrohemolysis第二部分正文第一章绪论粉防己碱(Tetrandrine，Tet)，别名汉防己甲素，是从防己科千金藤属植物汉防己（StephaniatetrandraS.Moore）干燥块根中提取的一种亲脂性生物碱，具有消炎、镇痛、抗纤维化、抗矽肺等药理作用[1]。近年来，粉防己碱在肿瘤治疗方面的作用引起了人们的极大关注[2-4]。但由于粉防己碱的水溶性差，半衰期较短，生物利用不高，细胞毒性较大等缺点，其临床应用受到了很大的限制。目前，国内已有的剂型为片剂和注射液，但片剂存在服用后溶散时限长、溶出度低、吸收较差、生物利用度较低等问题，影响治疗效果[5]。其注射液常以盐酸作为助溶剂，焦亚硫酸钠、依地酸钠作为稳定剂进行制备。由于受稳定剂、助溶剂及配制方法等因素的影响，注射剂存在易析出、贮藏时pH值下降、使用时出现疼痛等刺激反应等问题[6]，限制了其在临床方面的应用。因此，亟需开发一种合适的剂型来满足临床上的需求。近年来，脂质体作为载体在抗肿瘤药物中得到了广泛的研究，取得了较大的进展[7]。脂质体的组成与细胞膜相似，可包封脂溶性药物，形成具有双分子层结构的微型囊泡，从而降低药物的毒性，增加癌细胞对药物的摄取，是抗肿瘤药物的良好载体[8]。但普通的脂质体存在易发生药物渗漏造成包封率下降，长期储存发生聚合，易被网状内皮系统识别后被巨噬细胞吞噬，使其在体内作用时间变短等问题。近年来，用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）对脂质体膜进行修饰后可躲避被网状内皮系统识别，增加药物在体内的滞留时间[9,10]。图1脂质体示意图Fig.1Diagramofliposome本课题将粉防己碱制备成长循环脂质体，即粉防己碱长循环脂质体（Tetrandrinelong-circulatingliposome，Tet-LC-lipo），对其包封率、粒径、电位、形态进行表征，对稳定性、体外释放及溶血情况进行考察，并对其体外抗肺癌活性进行研究。第二章粉防己碱长循环脂质体的制备2.1材料与仪器2.1.1实验材料粉防己碱（西安昊轩生物有限公司，纯度>99%，批号：HXHFJJS20181012-1）胆固醇（日本精化株式会社，批号：B41239）大豆卵磷脂（艾伟拓（上海）医药科技有限公司，生产批号：SY-SI-181201）二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 （德国Lipoid公司，批号：588200-2170082-01）PBS缓冲液（上海源叶生物科技有限公司，批号：S16049-1L）2.1.2实验仪器：HJ-3控温磁力搅拌器（常州国宇仪器制造有限公司）ISO9001电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）KQ2200DB数控超声波清洗器2.2实验方法2.2.1粉防己碱长循环脂质体的处方筛选基于前期研究及检索相关文献，以胆固醇、磷脂、粉防己碱、DSPE-PEG2000等材料制备粉防己碱长循环脂质体，确定合适的处方比例。2.2.2粉防己碱长循环脂质体的制备及工艺优化（1）粉防己碱长循环脂质体的制备方法筛选通过薄膜分散法、乙醇注入法等方法制备粉防己碱长循环脂质体，以肉眼观察以及测定粒径大小的方式考察脂质体的外观和稳定性，筛选出合适的制备方法。薄膜分散法：精密称取处方量的胆固醇和磷脂，用氯仿将其溶解，置于烧瓶内用旋转蒸发仪将氯仿挥发，使脂质材料在烧瓶壁内形成薄膜。精密称取处方量的粉防己碱溶于磷酸盐缓冲溶液中，将溶液倒入成薄膜的梨形烧瓶中并进行旋转水化。最后将混悬液于磁力搅拌器中进行搅拌，后超声、过膜即得粉防己碱长循环脂质体[11]。乙醇注入法：精密称取处方量磷脂、胆固醇、粉防己碱、DSPE-PEG2000，用适量乙醇溶解，形成油相。再将油相缓慢注入40℃左右的PBS缓冲溶液中，不断搅拌，直至乙醇全部除去。将得到的溶液于冰浴中超声，后过膜即得粉防己碱长循环脂质体[12]。（2）粉防己碱长循环脂质体的制备工艺优化在薄膜分散法/乙醇注入法的基础上，比较长循环材料DSPE-PEG2000前插入法和后插入法对粉防己碱长循环脂质体的粒径、电位、包封率以及稳定性的影响，从而优化制备工艺。其中，前插入法是以预混合的方式，将磷脂、胆固醇、原药及DSPE-PEG2000混合所制备而成的长循环脂质体；后插入法是先将磷脂、胆固醇、原药制备成脂质体，再将DSPE-PEG2000插入到脂质体中所形成的长循环脂质体[13]。2.3实验结果2.3.1粉防己碱长循环脂质体的处方基于前期研究及检索相关文献，确定处方如下表1。表1粉防己碱长循环脂质体处方表Tab.1PrescriptionlistofTetrandrinelongcirculatingliposomes处方名称处方参数胆固醇:磷脂1:4粉防己碱:磷脂10:1DSPE-PEG20005%（总处方的摩尔比）磷酸盐缓冲液pH6.82.3.2粉防己碱长循环脂质体的制备及工艺优化（1）粉防己碱长循环脂质体的制备方法以薄膜分散法制备而成的粉防己碱长循环脂质体的粒径为203.57±2.86nm，放置5天后有沉淀析出。以乙醇注入法制备而成的粉防己碱长循环脂质体的粒径为53.80±2.48nm，呈半透明溶液状态，放置5天后且无析出。VladimirPTorchilin的研究表明，小尺寸（<100nm）的脂质体具有较强的通透性和滞留效应，可通过肿瘤血管并在肿瘤组织中进行积聚，从而精准地在目标组织上释放被包裹的药物[14]。因此，本实验选定乙醇注入法制备粉防己碱长循环脂质体。（2）粉防己碱长循环脂质体的制备工艺优化结果以乙醇注入法为前提，结合前插入法制备而成的粉防己碱长循环脂质体呈半透明溶液状态，平均粒径为51.79±1.24nm，PDI为0.17±0.02，Zeta电位为-0.37±0.34mV，包封率为80.13%±6.60%。结合后插入法制备而成的粉防己碱长循环脂质体外观呈乳白色透明，平均粒径为为118.75±1.99nm，PDI为0.21±0.03，Zeta电位为-1.86±1.53mV，包封率为77.38±2.1%。实验结果显示：在外观与粒径上，前插入法所制的样品较后插入法具有更小的粒径和更好的外观；在电位大小和包封率上，两种方法所得结果没有较大差异。因此，粉防己碱长循环脂质体优化后的制备工艺为乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法。优化后的制备工艺：精密称取处方量的磷脂、胆固醇、粉防己碱原药和DSPE-PEG2000，用适量的无水乙醇充分溶解，形成油相。量取处方量的磷酸盐缓冲液（PBS）于烧杯中，在水浴温度40℃、适当转速的磁力搅拌下，用注射器将油相缓慢滴入PBS中，并继续搅拌至无水乙醇挥发。将得到的溶液于冰浴中超声30min，依次用0.8，0.45，0.22μm的微孔滤膜过滤，即得[12,15]。粉防己碱普通脂质体除不含DSPE-PEG2000，其余实验条件与操作同上。第三章粉防己碱长循环脂质体的表征3.1材料与仪器3.1.1实验材料甲醇（色谱级，中国淮安市恒天工贸有限公司，批号：20180316）乙腈（色谱级，德国默克公司，批号：AS1122-801）三乙胺（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：T103287）3.1.2实验仪器ISO9001电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）TGL-16C离心机（上海安亭科学仪器厂）Nano-ZS90型激光粒径分析仪（英国Marlvern公司）3.2实验方法3.2.1粉防己碱长循环脂质体的表征（1）包封率的测定以乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法制备粉防己碱长循环脂质体平行样品3份，进行包封率的重复性试验。粉防己碱标准品的配制：精密称取10mg粉防己碱原料药于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线。采用超速离心法测定粉防己碱长循环脂质体的包封率。精密量取0.5ml原样品于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线后超声10min。从容量瓶中取1ml溶液至1.5ml离心管中，8000r/min离心5min。取上清液0.5ml至1.5ml离心管中，进样。HPLC所测浓度为C总。另精密量取1ml原样品于1.5ml离心管中，15000r/min离心30min，取上清液0.5ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度线后超声10min。从容量瓶中取出1ml溶液于1.5ml离心管中，8000r/min离心5min，取上清液0.5ml至1.5ml离心管中，进样，所测浓度为C包裹。其中，HPLC检测条件：色谱柱，DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温，30℃；进样量，20μL；流动相，水-乙腈-三乙胺=850:150:15；流速，1.0ml/min；检测波长，280nm[16]。按（1）式计算样品的包封率。包封率%=C（2）粒径及电位的测定量取0.5ml粉防己碱长循环脂质体原样品于5ml离心管中，加入2ml蒸馏水稀释，使磷脂的浓度为1mg/ml。用激光粒子分析仪测定脂质体的粒径和Zeta电位值。（3）形态观察将粉防己碱长循环脂质体样品稀释10倍，取适量滴于铜网上，滴加磷钨酸溶液进行染色。待铜网上的液体挥干后，用透射电镜观察粉防己碱长循环脂质体的形态[17]。3.2.2粉防己碱长循环脂质体的稳定性试验将粉防己碱长循环脂质体与粉防己碱普通脂质体在4℃和37℃下放置0、5、10天后，观察脂质体外观并测定其粒径和包封率，考察脂质体的稳定性情况。3.3实验结果3.3.1粉防己碱长循环脂质体的表征（1）包封率结果以乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法制备了3份粉防己碱长循环脂质体，其包封率结果见表2。实验结果显示，粉防己碱长循环脂质体的平均包封率为（80.13±6.60）%。表2乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法样品的包封率Tab.2EncapsulationefficiencyofsamplesbyethanolinjectioncombinedwithDSPE-PEG2000pre-insertionmethod组别123平均值SD包封率（%）87.75%76.41%76.24%80.13%6.60%（2）粒径和电位结果经激光例子分析仪检测，粉防己碱长循环脂质体的粒径分布较窄，呈单峰正态。平均粒径为51.79±1.24nm，PDI为0.17±0.02，Zeta电位为-0.37±0.34mV。粒径分布图见下图2所示。图2粉防己碱长循环脂质体粒径分布图Fig.2ParticlesizedistributionofTet-LC-lipo（3）形态观察结果通过透射电镜观察，粉防己碱长循环脂质体呈圆形或类圆形，大小分布较为均匀，微球之间的粘附性较弱。此外，还可观察到粉防己碱长循环脂质体的表面有一层水化膜，该层结构的的形成可能与DSPE-PEG2000与水分子之间形成的氢键有关。研究发现，该膜可影响脂质体与细胞之间的相互作用并产生较强的阻碍效应，从而减少与血浆中的成分结合以及逃避被巨噬细胞吞噬，发挥长循环效果[18]。图3粉防己碱长循环脂质体透射电镜图Fig.3TEMphotographofTet-LC-lipo3.3.2粉防己碱长循环脂质体的稳定性试验粉防己碱普通脂质体在第0~10天内，外观为乳白色澄清透明，在第5和10天时，4℃和37℃下，粒径明显变大，包封率下降较明显。粉防己碱长循环脂质体较稳定，外观比普通脂质体更澄清透明，10天内粒径和包封率在统计学上无明显差异。将脂质体于4℃和37℃下贮存，粒径与包封率无统计学上的差异。但相关文献显示[19]，将脂质体于4℃低温下贮存，其粒径大小及包封率变化更小，因磷脂于低温条件下贮存性质更稳定。本试验为10天的短期稳定性测定，结果只能表明粉防己碱脂质体制剂在短期内较为稳定，若判断制剂的长期稳定性，应进行周期更长的稳定性试验。图4粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体稳定性试验图Fig.4StabilitytestofTet-lipoandTet-LC-lipo图A：（左），4℃条件下，粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体在第0、5、10天时的粒径；（右）37℃条件下，粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体在第0、5、10天时的粒径。图B：（左）4℃条件下，粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体在第0、5、10天时的包封率；（右）37℃条件下，粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体在第0、5、10天时的包封率。Tet-lipo：粉防己碱普通脂质体；Tet-LC-lipo：粉防己碱长循环脂质体第四章粉防己碱长循环脂质体的体外评价4.1材料与方法4.1.1实验材料胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号20180218）胰蛋白酶（上海Biosharp公司，批号67055452）青链霉素溶液（上海Biosharp公司，批号66076128）DMSO（二甲基亚砜，广州赛国生物科技有限公司，批号：EZ1609C224）双抗（美国biosharp公司，批号：66076128）噻唑兰（MTT，杭州昊天生物技术有限公司，批号MKBG9627V）4.1.2实验仪器HAD-1080恒温震荡仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司）LC-20AT型高效液相色谱仪（日本岛津公司）DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备）4.2实验方法4.2.1粉防己碱长循环脂质体的体外释放研究模拟肿瘤细胞酸性微环境（pH6.8）以及人体体液环境（pH7.4）下药物的释放效果，从而评价脂质体制剂的缓释效果和靶向能力。以平衡透析法比较粉防己碱溶液、普通脂质体和长循环脂质体在pH6.8和pH7.4环境下的体外释药特性。分别量取粉防己碱溶液、普通脂质体和长循环脂质体1ml，装入已用碳酸氢钠和EDTA处理过的透析袋中，扎紧并放入缓冲溶液中。在温度为（37±0.5）℃的恒温振荡器中进行震荡。在固定的时间间隔内进行取样，同时补加等体积的缓冲溶液。样品需经0.22μm微孔滤膜过滤后再经HPLC测定[11,20]。计算累积释放率，并作随时间变化的曲线图。4.2.2粉防己碱长循环脂质体的体外溶血评价（1）2%红细胞混悬液的制备：取健康大鼠血于含有抗凝剂的离心管中，2000r·min-1离心5min，弃上层血浆。加入约10倍量的生理盐水，摇匀，4℃低温离心（2000r·min-1）5min，弃上清液，用生理盐水洗涤沉淀2~3次，直至上清液不呈红色为止。吸取0.2ml红细胞，用生理盐水稀释至10ml，即得2%红细胞混悬液[21-23]。（2）实验分组取洁净玻璃试管17只，编号，各管分别依次加入粉防己碱溶液、粉防己碱普通脂质体或粉防己碱长循环脂质体，用生理盐水、纯化水混匀，最后每管加入红细胞混悬液，混匀后立即置（37±0.5）℃的恒温水浴箱中进行孵育3h，取出后以1800r·min-1离心10min[21-23]。（3）肉眼观察法若试管中溶液为澄明红色，管底无细胞残留或有仅有少量红细胞残留，表明发生溶血；若红细胞全部下沉，上清液无色澄明，表明没有发生溶血。（4）分光光度法通过分光光度法对粉防己碱溶液、粉防己碱普通脂质体和粉防己碱长循环脂质体的溶血作用进行进一步评价。将温育后各管溶液心5min后吸取上清液，以纯水作为空白对照，用紫外分光光度计在575nm波长处测定吸收度（OD值）。溶血率计算公式如下（1）：溶血率A1为各供试品的吸光度，A0为阴性对照吸光度，A2为阳性对照吸光度，溶血率>5%表明出现溶血。4.2.3粉防己碱长循环脂质体的体外抗肺癌作用以MTT法评价粉防己碱长循环脂质体对人肺腺癌细胞株A549细胞增殖抑制作用。（1）A549细胞的培养和处理将复苏A549细胞悬液移入到细胞培养瓶内，在5%CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。定期更换细胞培养液，传代[24]。（2）实验分组本实验分8组，分别为细胞不给药组（第1组）；Tet-溶液对照组（第2组）；Tet-LC-lipo干预组（第3、4、5、6、7组）；空白脂质体组（第8组）。c.细胞增殖抑制率测定：选取处于对数生长期的A549细胞，加入培养液（含10%胎牛血清），调整细胞浓度为5×104mL-1，接种于96孔板，每孔100μL。于5%CO2、37℃恒温培养箱中进行培养，待细胞铺满孔底时开始给药。第1组不给药，第2组每孔各加入100μLTet-溶液，第3~7组每孔各加入100μLTet-LC-lipo，第8组每孔加入100μL空白脂质体。将96孔板于5%CO2、37℃恒温培养箱中分别培养24、48h。弃去96孔板内液体后加入培养液，避光加入20μLMTT溶液，在恒温培养箱中培养4h后弃去上清液，使用酶标仪测定490nm处吸光值（OD值），按公式（2）计算细胞增殖抑制率[8,24]。细胞3.3实验结果3.3.1粉防己碱长循环脂质体的体外释放研究粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体的体外释放曲线见图5。粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体的体外释放药物过程相似，都具有缓释效果。但在相同条件下，粉防己碱普通脂质体的释药速率略大于粉防己碱长循环脂质体。粉防己碱脂质体在pH=6.80条件下的体外累积释放度大于pH=7.40条件下的释放度，这有助于脂质体靶向肿瘤组织实现定向释放粉防己碱，增强药物在靶组织的药效，减少药物在正常体液环境中释放，从而降低对正常人体细胞的毒性作用，从而实现精准治疗。脂质体的释药过程呈现了两个不同的阶段：第一阶段为前8h的快速释放阶段，该过程可能与部分粉防己碱药物吸附在脂质体的表面而未被包封入内有关，吸附在脂质体表面的游离粉防己碱很容易从基质中扩散，而包封于脂质体内的粉防己碱则会在后续进行缓慢释放[25]。第二阶段为缓慢释放阶段，呈现持续、平缓的释药趋势。该过程可能与粉防己碱被包封于脂质体内，脂质体中的胆固醇对磷脂双分子层结构有一定的稳固作用，增强了脂膜的刚性，从而减缓药物的释放速率，起到缓释和长循环的效果。此外，由DSPE-PEG2000修饰的粉防己碱长循环脂质体于普通脂质体相比，具有更好的缓释效果，这可能与DSPE-PEG2000可以与水相形成水化膜，增加“位阻”效果以及PEG链可以交叉包裹在脂质体的表面，从而更进一步地延缓药物释放[26]。在t=48h结束测定时，在pH7.4下，粉防己碱普通脂质体的累计释放率达84.54%，粉防己碱长循环脂质体的累积释放率达77.34%。粉防己碱脂质体中药物的初始突释和后续缓释部分都具有临床应用价值，最初的突释有助于改善药物渗透和推动药物活性的更快起效时间，而药物的持续释放延长其在体内的循环时间[27]。图5粉防己碱普通脂质体与粉防己碱长循环脂质体体外释放曲线Fig.5CumulativereleasepercentageofTet-lipoandTet-LC-lipo为研究粉防己碱长循环脂质体对的体外释药机制，用不同的数学模型对pH=6.8条件下粉防己碱长循环脂质体的体外释放数据进行拟合，结果如表3所示。数据显示，粉防己碱长循环脂质体的体外释药曲线符合Weibull方程，具有较高的相关系数r，即lnln(1/(1-Q))=0.4565lnt-1.066，r^2=0.9223。其中，Q为累积释放率，t为取样时间。表3粉防己碱长循环脂质体体外释药曲线拟合结果Tab.3FittingresultofreleasecurveofTet-LC-lipo拟合方程方程式r^2零级动力学方程Q=0.0109t+0.41840.5072一级动力学方程ln(1-Q)=-0.02544t-0.61460.6055Higuchi方程Q=0.09454t1/2+0.270.7227Weibull方程lnln(1/(1-Q))=0.4565lnt-1.0660.92233.3.2粉防己碱长循环脂质体的体外溶血结果（1）肉眼观察法结果根据实验图6可知，粉防己碱普通脂质体与长循环脂质体均可以改善粉防己碱溶液所致的红细胞溶血情况。图6Tet-LC-Lipo、Tet-Lipo及Tet溶液的溶血作用Fig.6HemolysistestofTet-solution,Tet-lipoandTet-LC-lipobyspectrophotometry1:25μg·mL-1Tet溶液；2:50μg·mL-1Tet溶液；3:100μg·mL-1Tet溶液；4:200μg·mL-1Tet溶液；5:500μg·mL-1Tet溶液；6:25μg·mL-1Tet-Lipo；7:50μg·mL-1Tet-Lipo；8:100μg·mL-1Tet-Lipo；9:200μg·mL-1Tet-Lipo；10:500μg·mL-1Tet-LipoB;11:25μg·mL-1Tet-LC-Lipo；12:50μg·mL-1Tet-LC-Lipo；13:100μg·mL-1Tet-LC-Lipo；14:200μg·mL-1Tet-LC-Lipo；15:500μg·mL-1Tet-LC-Lipo；；16：阴性对照-0.9%氯化钠溶液；17：阳性对照-蒸馏水B（2）分光光度法结果表4粉防己碱溶液、普通脂质体及长循环脂质体的溶血试验结果(n=3,x±s)Tab.4HemolysistestofTet-solution,Tet-lipoandTet-LC-lipobyspectrophotometry(n=3,x±s)No.Tet溶液No.Tet-LipoNo.Tet-LC-LipoTet浓度/μg·mL-1溶血率/%Tet浓度/μg·mL-1溶血率/%Tet浓度/μg·mL-1溶血率/%1250.18±1.436250.27±2.8911250.08±2.7025010.96±3.647502.77±1.1912500.69±1.99310028.45±0.5181003.65±0.49131001.44±1.36420032.13±0.7492005.45±0.75142003.05±0.51550040.02±0.89105008.03±0.13155004.84±0.25根据表4显示，粉防己碱溶液具有较强的溶血能力；粉防己碱普通脂质体可在一定程度上缓解粉防己碱溶液对红细胞的溶血情况，但当脂质体浓度在200μg·mL-1左右及以上时，仍存在溶血情况；粉防己碱长循环脂质体可较大程度地缓解溶血作用。因粉防己碱溶液的溶血作用会对心脏、肾脏等器官产生较强的刺激性，从而限制了其以静脉注射的形式应用于临床实践[28]。将粉防己碱制备成长循环脂质体制剂可大幅度进行改善，解决溶血问题，其机制可能与长循环脂质体磷脂分子上插有DSPE-PEG2000，可使脂质体表明有较好的亲水性，并且可与水相形成水化膜，减少脂质体与红细胞中的胆固醇结合从而使红细胞发生破裂有关[29]。因此，有望将粉防己碱制备成长循环脂质体应用于临床静脉注射。3.3.3粉防己碱长循环脂质体的体外抗肺癌作用结果在不同给药浓度下，各组A549细胞的抑制率如表5及增殖抑制图如图7。结果显示，粉防己碱被制成长循环脂质体后仍具有抑制A549细胞增长的效果。随着粉防己碱的浓度增加，作用时间延长，对A549细胞的增殖抑制作用增强。当浓度达到20μg/ml，作用24h时，粉防己碱溶液、粉防己长循环脂质体对A549细胞的增殖抑制率分别为74.79%，53.00%。粉防己长循环脂质体的抑制效果与粉防己见溶液相比较弱，可能与部分药物仍被包封于脂质体内未完全释放有关。当浓度达到20μg/ml，作用48h时，粉防己碱溶液、粉防己长循环脂质体对A549细胞的增殖抑制率分别为97.00%，89.76%。与24h增殖抑制实验相比，两者抑制效果的差距显著缩小，且粉防己碱长循环脂质体的抑制率增长幅度大于粉防己碱溶液，说明前者具有较好的缓释效果。空白脂质体对A549细胞的生长无明显影响，说明材料本身无细胞毒性。表5MTT法检测不同浓度下粉防己碱溶液、长循环脂质体及空白脂质体对A549细胞的增殖抑制率(n=4,x±s)Tab.5InhibitionrateofA549cellsatdifferentconcentrationsofTet-lipo,Tet-LC-lipoandblank-LC-lipobyMTTmethod(n=4,x±s,%)1.25μg/ml2.5μg/ml5μg/ml10μg/ml20μg/mlTet-solution24h31.67±6.6435.10±2.2036.08±5.2054.48±3.9774.79±3.69Tet-solution48h39.91±0.4553.48±3.2071.55±9.4492.05±2.6997.00±2.83Tet-LC-lipo24h18.98±7.1528.03±8.1930.94±5.5442.73±6.3653.00±4.10Tet-LC-lipo48h35.82±13.2343.90±12.6858.16±6.0678.30±5.8789.76±8.53Blank-LC-lipo24h1.93±1.723.12±3.243.57±2.903.22±3.784.72±2.31Blank-LC-lipo48h1.52±3.154.57±5.105.23±3.824.46±4.326.17±4.13CD图7粉防己碱溶液、粉防己碱长循环脂质体及空白脂质体对A549的增殖抑制柱状图Fig.7InhitbitionofA549bargraphcellbyTet-solution,Tet-LC-lipoandBlank-LC-lipo图C：24h时，粉防己碱溶液、粉防己碱长循环脂质体及空白脂质体对A549的增殖抑制图。图D：48h时，粉防己碱溶液、粉防己碱长循环脂质体及空白脂质体对A549的增殖抑制图。Tet-solution:粉防己碱溶液；Tet-LC-lipo：粉防己碱长循环脂质体；Blank-LC-lipo：空包脂质体.结论及展望1.粉防己碱长循环脂质体的制备：以乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法制备粉防己碱长循环脂质体的方法可行，该法所制的样品粒径与电位较小，不仅易于在肿瘤组织中积聚释放药物，而且对正常细胞的毒性较小。包封率较高，稳定性较佳。2.粉防己碱长循环脂质体的表征：以乙醇注入结合DSPE-PEG2000前插入法制备的3份粉防己碱长循环脂质体平行样品，包封率为（80.13±6.60）%，粒径为51.79±1.24nm，PDI为0.17±0.02，Zeta电位为-0.37±0.34mV。在透射电镜下观察，粉防己碱长循环脂质体呈圆形或类圆形，分布较为均匀。在10天的稳定性试验中，结果较好。3.粉防己碱长循环脂质体的体外试验：粉防己碱长循环脂质体的体外释药具有平稳、缓释的效果，没有溶血情况，且对人肺腺癌细胞A549有明显的抑制效果，该结果为粉防己碱长循环脂质体用于临床上治疗肺癌奠定了实验基础。4.展望：（1）对粉防己碱长循环脂质体进行正常肺上皮细胞增殖抑制试验，考察对正常细胞的毒性作用。（2）对粉防己碱长循环脂质体进行体内药动学研究，考察体内是否具有长循环作用。（3）对粉防己碱长循环脂质体进行体内药效学研究，考察体内是否具有抑瘤效果。参考文献GuoK,CangJ.Anoveltetrandrine-loadedchitosanmicrosphere:characterizationandinvivoevaluation.DrugDesDevelTher.2016;10:1291‐1298.Published2016Mar30.LiuT,LiuX,LiW.Tetrandrine,aChineseplant-derivedalkaloid,isapotentialcandidateforcancerchemotherapy[J].Oncotarget,2016,7(26):40800-40815.XuW,DebebBG,LacerdaL,etal.Tetrandrine,aCompoundCommoninChineseTraditionalMedicine,PreferentiallyKillsBreastCancerTumorInitiatingCells(TICs)InVitro[J].Cancers,2011,3(4):2274-2285.TingCT,LiWC,ChenCY,etal.PreventiveandtherapeuticroleoftraditionalChineseherbalmedicineinhepatocellularcarcinoma[J].JournaloftheChineseMedicalAssociation,2015,78(3):139-144.黄大权，唐新.一种治疗硅肺、风湿痛、关节痛及神经痛的药物及其制备方法.中国专利：201710306854.6，2017-09-29.陈彦，瞿鼎，黄萌萌.含有汉防己甲素的组合物注射剂及其制备方法.中国专利：201610882317.1，2019-04-09.张小琴.抗肿瘤中药中脂质体的应用研究.阿坝师范学院学报，2013，30（2）：125-128.宫亮.姜黄素Ⅲ脂质体制备及其对肺癌细胞A549生物学特性的影响.第三军医大学，2004.LuM,ZhaoX,XingH,etal.Liposome-chaperonedcell-freesynthesisforthedesignofproteoliposomes:Implicationsfortherapeuticdelivery[J].ActaBiomaterialia,2018,76:1-20.SylvesterB,PorfireA,VanBockstalPJ,etal.FormulationOptimizationofFreeze-DriedLong-CirculatingLiposomesandIn-LineMonitoringoftheFreeze-DryingProcessusinganNIRSpectroscopyTool[J].JournalofPharmaceuticalSciences,2017,107(1):139-148.蔡鑫君,王丛瑶,倪坚军,等.唑来膦酸阳离子脂质体的制备及其体外特性表征.中国现代应用药学,2015,32(2):161-165.张晓丽,吴品昌,刘宇,等.乙醇注入法制备莪术醇脂质体.中国实验方剂学杂志,2012,18(4):10-12.RasmusEliasen,ThomasL.Andresen,JannikB.Larsen.PEG‐LipidPostInsertionintoDrugDeliveryLiposomesQuantifiedattheSingleLiposomeLevel[J].AdvancedMaterialsInterfaces,2019,6(9).TorchilinVP.Passiv