丝素蛋白纯度检测方法

3丝素蛋白纯度检测方法2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法JJF1059.1测量不确定度评定与表示3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1丝素蛋白silkfibroin从天然蚕丝中去除丝胶后得到的主要蛋白质成分，由重链、轻链及P25糖蛋白组成，具有良好的生物相容性和可降解性。3.2丝素蛋白纯度purityofsilkfibroin在检测样品中，丝素蛋白的质量占样品总质量的百分比，不包含样品中的水分、灰分、残留脱胶剂、小分子有机物杂质等。3.3空白试验blanktest在不加样品的情况下，按照与样品试验相同的步骤、试剂用量和试验条件进行的试验，用于消除试验过程中试剂、环境等因素对检测结果的干扰。3.4平行试验paralleltest4原理4.1凯氏定氮法原理通过凯氏烧瓶将样品与浓硫酸、催化剂混合加热，使样品中的有机氮转化为硫酸铵；加入氢氧化钠溶液，将硫酸铵转化为氨气并蒸馏出来，用硼酸溶液吸收氨气；采用标准盐酸溶液滴定吸收液，根据盐酸的消耗量计算样品中的总氮含量，再依据蛋白质换算系数计算得到粗蛋白质含量。4.2灰分校正法原理通过将样品在马弗炉中高温灼烧，使有机成分完全燃烧分解，残留的无机成分即为灰分；根据灰分质量计算灰分含量，对凯氏定氮法得到的粗蛋白质含量进行校正，最终得到丝素蛋白纯度。45试验条件5.1环境条件试验环境应符合下列规定。a）环境温度23±2）℃。b）相对湿度：（45±15）%。c）大气压力86～106）kPa（标准大气压范围）。d）实验室洁净度：无粉尘、无腐蚀性气体。e）光照条件：滴定终点观察区域光照强度≤500lx。5.2试验器具预处理试验器具预处理应符合下列规定。a）凯氏烧瓶、消化管、蒸馏装置等玻璃器皿：使用前应用10%盐酸溶液浸泡24h，再用GB/T6682规定的一级水冲洗至中性，最后放入电热干燥箱中，在（105±2）℃下干燥2h，冷却至室温后使用。b）瓷坩埚（用于灰分测定）：使用前应在马弗炉中于（550±25）℃下灼烧2h，取出后放入干燥器中冷却至室温，称量至恒重（冷却至室温后立即称量，两次称量间隔不超过30min，两次称量差值不大于0.0002g）。c）滴定管、移液管等计量器具：使用前应按照GB/T601的要求进行校准。6试剂和材料6.1试剂规格试验所用试剂均为分析纯（AR），除非另有规定；试验用水应符合GB/T6682规定的一级水（电导率不大于0.01mS/m，25℃)。6.2具体试剂和材料清单具体试剂和材料清单应符合表1规定。表1试剂和材料清单6.3试剂制备试剂制备应符合下列规定。a）催化剂混合物：将硫酸铜与硫酸钾按照质量比1:10混合均匀，研磨至粉末状，储存于干燥试剂瓶中备用。b）氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400.0g氢氧化钠固体，加入适量一级水中，搅拌至完全溶解，冷却至室温后，用一级水定容至1000mL，储存于聚乙烯试剂瓶中，密封备用（配制后7天内使用）。5c）硼酸吸收液（20g/L）：称取20.0g硼酸固体，加入800mL一级水中，搅拌至完全溶解，用一级水定容至1000mL，储存于玻璃试剂瓶中备用（配制后15天内使用）。d）混合指示剂：称取0.1g甲基红和0.05g溴甲酚绿，加入50mL无水乙醇中，搅拌至完全溶解，用无水乙醇定容至100mL，储存于棕色试剂瓶中，避光备用（配制后30天内使用）。e）标准盐酸滴定溶液（0.1mol/L）：按照GB/T601的规定制备和标定，量取8.3mL盐酸，缓慢加入1000mL一级水中，搅拌均匀；采用基准无水碳酸钠进行标定，平行标定3次，相对平均偏差不大于0.2%，标定结果作为盐酸标准溶液的实际浓度。7仪器设备7.1仪器设备清单仪器设备清单应符合表2规定。表2仪器设备清单），7.2仪器设备安装要求仪器设备安装应符合下列规定。a）凯氏定氮仪：安装在通风橱内，通风橱排风量不小于1200m³/h，仪器水平放置，与电源、水源连接牢固，接地良好。b）马弗炉：安装在平整、防火的地面上，周围无易燃物品，与墙壁距离不小于50cm，电源线路符合功率要求（不小于2kW）。c）电子分析天平：安装在防震实验台上，远离热源、水源和磁场，实验台水平误差不大于0.1mm/m，天平室内无明显气流。8样品8.1样品类型及预处理样品类型及预处理应符合下列规定。a）丝素蛋白粉末样品：1）若样品结块，应将其放入研钵中轻轻研磨，过80目标准筛，去除大颗粒杂质；2）若样品含水量较高，应先将样品放入电热干燥箱中，在（60±2）℃下干燥4h，冷却至室温后再进行后续处理。b）丝素蛋白溶液样品：1）若溶液浑浊或含有不溶性杂质，采用定性滤纸过滤，收集滤液作为检测样品；62）若溶液浓度过低，应将溶液放入旋转蒸发仪中，在（50±2）℃、真空度（0.08～0.09）MPa条件下浓缩至固含量不小于10%，冷却至室温后备用。c）丝素蛋白膜样品：1）将样品裁剪成边长为1cm的正方形小块，混合均匀；2）若样品厚度超过1mm，应用切片机将其切成厚度不大于0.5mm的薄片，便于后续消化完全。8.2样品尺寸及数量样品尺寸及数量应符合表3规定。表3样品尺寸及数量8.3状态调节与储存状态调节与储存应符合下列规定。a）状态调节：（23±2）℃、（50±5）%湿度，平摊（厚不大于5mm），不小于24h。b）储存：待测试样调节环境存不大于48h；已测试样（4±2）℃冷藏不小于3个月；标准品（4±2）℃冷藏，每6个月查纯度。9试验步骤9.1试验准备试验准备应符合下列规定。a）仪器检查：1）凯氏定氮仪：消化炉达420℃±5℃,蒸馏气密性好，滴定无漏液；2）马弗炉：550℃±25℃稳定，空白坩埚使用前灼烧至恒重，灼烧温度均匀（差不大于10℃);3）天平：预热30min，标准砝码校准。b）试剂检查：检查试剂有效期，氢氧化钠/硼酸液无浑浊，盐酸标液超1个月重标定。9.2凯氏定氮法测粗蛋白质凯氏定氮法测粗蛋白质应符合下列规定。a）样品消化：1）称样（精确至0.0001g）入500mL凯氏烧瓶，加6.0g催化剂，摇匀；2）加20mL浓硫酸，瓶口放漏斗防飞溅；3）消化炉程序：200℃30min→420℃±5℃至溶液透明蓝绿色，再30min；4）冷却至室温（约1h）。b）空白与蒸馏吸收：1）空白：除不加样品外，其余步骤完全相同，同法消化；2）蒸馏：消化液转蒸馏瓶，50mL水分3次冲洗；吸收瓶加50mL硼酸液+5滴指示剂，出口浸没液面（1～2）cm；加100mL氢氧化钠液（400g/L），蒸馏5min（或150mL±10mL）；结束前1min移吸收瓶，冲洗出口。c）滴定：标液盐酸（0.1mol/L）滴定至溶液绿转暗红（30s不褪），记录消耗量；空白同法，平行3次样、2次空白。9.3灰分测定灰分测定应符合下列规定。a）称量与炭化：1）恒重瓷坩埚，称样（样品质量取值范围为2.0g～3.0g，称量精度应达到0.0001g72）（105±2）℃干燥2h，通风橱内酒精灯小火炭化至无黑烟（30min～60min）。b）灰化与空白：1）灰化：550℃±10℃灼烧4h，干燥器冷却称量；灼烧1h后称量，至两次灼烧后的质量差值不大于0.0005g；2）空白：恒重坩埚同法炭化灰化，算空白灰分。9.4试验终止与后处理终止条件：样品溅出、装置漏气、指示剂变色不明显、马弗炉超600℃、样品明火；后处理：仪器清洗（凯氏定氮仪盐酸洗后水洗，瓷坩埚稀盐酸洗），废液分类处理。10试验数据处理10.1粗蛋白质含量计算粗蛋白质含量按式（1）计算：式中：CP——粗蛋白质含量（%）；V₁——样品耗盐酸体积（mL）；V₀——空白耗盐酸体积（mL）；C——盐酸浓度（mol/L）；Mn——氮元素的摩尔质量，取值为0.0140（kg/mol）；K——丝素蛋白专属蛋白质换算系数，取值为6.25；m——待测试样的质量（g）。10.2灰分含量计算灰分含量按式（2）计算：A式中：A——灰分含量（%）；mt——瓷坩埚与样品灰分的恒重总质量（gm0——空瓷坩埚的恒重质量（gmb——白试验的灰分质量（gms——用于灰分测定的待测试样质量（g）。10.3丝素蛋白纯度计算丝素蛋白纯度按式（3）计算：P=X1—X2………(3)式中：P——丝素蛋白纯度（%）；X1——粗蛋白质含量的3次平行试验平均值（%）；X2——灰分含量的3次平行试验平均值（%）。11精密度和测量不确定度11.1精密度精密度应符合下列规定。a）重复性：同条件下6次测标准品（不小于99.0%），RSD不大于1.5%，最值差不大于0.30%。b）再现性：不同实验室3次测标准品，RSD不大于3.0%，室间差不大于0.60%。8c）验证：每季度测标准品，达标则方法有效，否则整改重测。11.2测量不确定度测量不确定度应符合下列规定。a）来源：样品称量、盐酸标液、消化过程、灰分测定、空白试验。b）评定：按JJF1059.1，建立数学模型→算各分量标准不确定度→丝素蛋白纯度检测结果的合成标准不确定度→扩展不确定度。c）扩展不确定度要求：1）当检测得到的丝素蛋白纯度不小于90.0%时，扩展不确定度应不大于1.0%；2）当检测得到的丝素蛋白纯度不小于80.0%且小于90.0%时，扩展不确定度应不大于1.5%；3）当检测得到的丝素蛋白纯度小于80.0%时，扩展不确定度应不大于2.0%。12质量保证和控制12.1参考样件控制选纯度不小于99.0%标准品作参考样4±2）℃冷藏，每3个月查外观与纯度。12.2试验有效性判定有效条件：空白粗蛋白不大于0.10%、空白灰分不大于0.05%，平行样相对标准偏差达标，仪器无故障，数据完整无涂改；否则重测并记录原因。13试验报告试验报告应符合下列规定。a）报告编号：SLDB-年份-月份-序号。b）样品