生物催化技术

生物催化技术

*商要：本文主要探讨生物催化剂得种类、生物催化酶得制备、表征、应用等方

面。其中固定化酶有许多粗酶液没有得特点，但制备固定酶首先要经过大量复杂

得分离、纯化工作，而且一种固定化酶只能用于特定得单步反应，以及对现代生物

催化技术得发展及研究。

关键词：生物催化剂；性质；用途；发展

引言：

生物催化剂就是游离得或固定得细胞或酶得总称，它们在生物反应中起着催

化剂得作用。

生物催化就是利用生物催化剂，改变（通常就是加速）化学反应速率，合成有

机化学品与药物制品。生物催化涉及三个学科得不同部分：化学中得生物化学与

有机化学；生物学中得微生物学、分子生物学与酶学；化学工程学中得催化、传递

工程与反应工程学。人类很早就知道利用酶与微生物细胞作为生物催化剂进行生

物催化已有几千年历史，早已发明了麦芽制曲酿酒工艺，古埃及与古代中国都有

历史记载。近现代认识酶就是与发酵与消化现象联系在一起得。后来创造了“酶”

这一术语以表述催化活性，近代科学技术对酶得认识研究，成为现代酶学与生物

催化研究得基础［。

现代科学技术以及化工行业得不断发展，对于催化剂得要求越来越高，人们

不断探索新得催化技术以满足不发展得化工行业得需求。与化学工业相反，生物

催化技术工业就是产销量不大得行业，主要应用与制药领域及少数得化工行业及

视频行业。生物催化技术对化学工业得影响主要就是可再生资源得生物加工。

自生物技术诞生之日起，人们就一直致力于把它应用到工业生产当中去，工

业生物催化技术就是生物技术应用中一个新兴与关键得领域。生物催化技术首先

从与它联系做紧密得医药、农业开始，逐渐涉及到化工、材料等行业，并通过它们

影响社会生产、生活得各个方面。美国21实际发展规划中预计，到2020年，通过

生物催化技术，将实现降低化学工业原料消耗、水资源消耗、能量消耗30%,减少

污染物得排放与污染扩散

以蛋白质酶得工程应用为核心得工业生物催化技术，被认为就是生物技术继

生物医药与转基因植物之后得第三次浪潮。它得发展与应用将对人类得工业化学

过程带来根本得变革。

工业生物催化得兴起与以下得两个关键技术因素有密切得关系：（1）蛋白质

定向进化技术得出现，⑵基因组学与蛋白质组学得发展。探讨了工业生物催化技

术得现状与发展趋势，

并对我国如何发展该领域得基础与应用研究提出一些见解。

1、生物催化剂得种类及性质

1、1生物催化剂得种类：

从酶得作用与功能得发现过程中了解到，人们最早使用得就是游离得细胞活

体，即使用这些细胞中得酶作为生物催化剂；在此基础上考虑将该酶蛋白质从细

胞中提取分离出来。

比较纯得催化剂形态进行得反应催化，也可以采用固定化技术将酶或细胞固

定在惰性固体表面后再使用。

因此，固定化细胞与固定化酶又称固定化催化剂

生物催化剂得类别如下：

生长细胞、休止细胞、冻干细胞、处理细胞

1、2生物催化剂得性质

生物催化剂具有催化高效性，催化种类得专一性及反应条件专一性三大基本

性质。生物催化剂得三大特征决定了生物催化剂得广泛得用途［6］。

2、固定化酶得制备方法：

2、1传统得制备方法:

2、1、1吸附法

吸附法就是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻

摘、离子交换树脂等载体上得固定方式。显著特点就是：工艺简便及条件温与，

包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化与固定化；酶失活后可重新

活化，载体也可再生。但要求载体得比表面积要求较大，有活泼得表面。

2、1、2包埋法

包埋固定化法就是把酶固定聚合物材料得格子结构或微囊结构等多空载体

中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅就

是被包埋起来，生物活性被破坏得程度低，但此法对大分子底物不适用。

（1）网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状得固定化酶，称为网

格型包埋法。也称为凝胶包埋法。（2）微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成得

小球内，制成固定化酶。由于形成得酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以

也称为微囊化法。

2、1、3结合法

酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定得方法，叫

离子键结合法。其间形成化学共价键结合得固定化方法叫共价键结合法。共价键

结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶得脱落，稳定性能好。该法得缺点就是

载体得活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控

制条件才能获得活力较高得固定化酶。

2、1、4交联法

交联法就是用多功能试剂进行酶蛋白之间得交联，使酶分子与多功能试剂之间形

成共价键，得到三向得交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定

得分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：（1）单独与酶作用；（2）

酶吸附在载体表面上再经受交联；（3）多功能团试剂与载体反应得到有功能团

得载体，再连接酶。交联剂得种类很多，最常用得就是戊二醛，其她得还有异氨酸

衍生物、双偶氮二联苯胺、N,N-乙烯马来酰亚胺等。交联法得优点就是酶与载体

结合牢固，稳定性较高；缺点就是有得方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易

造成酶失活。

2、2新型得制备方法：

2、2、1共价固定法：

酶分子表面存在很多可供利用得化学基团。选择性地利用酶分子表面远离活

性位点得特定稀有基团(如硫基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联

来同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向得目得。

Collioud等化学合成一个异双功能试剂(N-[m-[3-

(trifIuoromethyI)diazirin-3-yI]phenyI]一4一maIeimidobutyramide),她

们利用这种双功能试剂成功地实现了氨基酸、合成肽与抗体Fab片段得定向固

定。Stein等通过衍生全鼠叠氮基苯疏水交联共价固定一种脂链细胞蛋白，取得

了一致得空间取向。固定后得蛋白质分子结合牢固、稳定性佳，不能被离子或非

离子去污剂清除。

2、2、2氨基酸置换法：

利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过

该氨基酸残基特殊得侧链基团控制固定方向。Huang等通过定点突变在枯草蛋白

酶(subtiI2isin)分子表面远离活性中心得位置弓入半胱氨酸(Cys)残基。经蛋白

质空间折叠后暴露出Cys,然后利用Cys残基上得瞌基固定枯草蛋白酶分子，取得

了较好得固定效果，固定效率与固定后催化活性均有很大提高。

2、2、3抗体耦联法：

大多数抗体具有足够得稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可

供偶联用得官能团可以通过赖氨酸得£-氨基或末端氨基、天冬氨酸得B-氨基、

谷氨酸得Y-氨基或末端瓶基进行一般性得偶联。Spitznagel等用碘乙酸活化多

孔玻璃珠来定向固定抗体酶(abzyme)48G7-4A1得Fab片段，抗体酶Fab片段保

持了很好得催化活性。抗体分子Fc区得糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上

得氨基通过缩合反应可实现定向固定。醛基若与载体上得酰腓通过踪键结合实现

抗体分子得定向固定，与随机固定相比，固定后抗体稳定性提高得同时免疫吸附

活性也提高了3倍。

2、2、4生物素一亲与素亲合法：

生物素就是存在于所有活细胞内但含量甚微(<0.0001%)得中性小分子辅

酶。亲与素就是一个含有四个相同亚基得四聚体，每个亚基均含一个生物素结合

位点(解离常数10~5moi/L)o生物素与亲与素或相应细菌中得链霉亲与素有高

专一性得、极强得亲与力。这种特性使其成为免疫分析、受体研究、免疫组织化

学、基因工程与蛋白质分离等领域中独特有力得工具。

2、2、5疏水定向固定法：

细胞粘着分子(celladhesionmoIecuIes,CAMs)就是介导细胞-细胞、细胞一

底物粘着、细胞发育与细胞信号发生得分子。细胞粘着分子与其它细胞表面分子

通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定就是常选择得方式。接触位点A糖

蛋白就是调节发育得细胞粘着分子，产生于多细胞发生早期，通过形成高亲与、

EDTA稳定得接触位点介导细胞粘着。接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水同

定在细胞表面。疏水定向固定可保持蛋白质分子结构、生理活性及天然构象。这

种通过疏水作用得固定，固定得效率高，固定为非共价，而且固定过程可逆，用去

污剂可终止或消除同定应。Stein等用庚基胺修饰照甲基葡聚糖载体表面得竣基

来疏水固定接触位点A糖蛋白分子，成功地控制了固定位点得空间取向。用mAb7l

特异结合来检测csA得活性状态，mAb71结合良好，而mAb353则不能结合。

2、2、6微波/超声辅助固定化：

微波就是一种电磁波，波长为0、1~100cmo微波加热得主要原理就是介质

材料得极性分子在微波高频电场得作用下反复快速取向转动而摩擦生热，就是从

物质内部开始，瞬时达到需要得温度。微波加热具有许多传统加热不具备得优点，

包括：加热迅速、均匀，不需要热传导过程，内外同时加热，加热时间短；加热质量

高，营养破坏少；节能高效；易于控制功能等超声波就是指振动频率大于20kHz

以上得一种纵波，在介质中传播时，使介质发生物理得与化学得变化，从而产生一

系列超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应与化学效应。研究认为，超声波

对液体化学反应速度与产率得影响主要就是超声波在液体介质中得空化作用，超

声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量得释放，可以提高许多化学反应得

速度。到目前为止，超声波技术对物质提取，高分子降解，酶解反应等都有很好得

促进作用。其中超声波酶解反应具有高效、廉价、无污染，可提高酶促反应速度

与有效成分得产率。

3酶固定化原理

经戊二醛活化得戟体具了能与蛋白酶分子得自由氨基反应得基团，及-CHO。

经过戊二醛活化得载体与酶蛋白分子得反应机理就是戊二醛得另一个没有与为

载体相连得-CHO再与酶分子得氨基反应，形成-N二C-键，从而将酶分子固定在载

体上。在加入酶液前必须将过量得戊二醛试剂洗去，因为戊二醛就是一种交联剂，

它能与酶分子交联，使酶分子之间形成共价键，得到三维网状交联结构。此外，戊

二醛就是蛋白得变性剂，过量得戊二醛本身会使蛋白质分子中毒，降低酶得活性，

具体反映得机理如图所示。

4、生物催化酶得光谱表征:

还原型辅酶(NADH)得光谱吸收曲线(吸收峰分别在260nm与340nm)

还原型辅酶（NADH）的吸收光谱曲线

生化谷丙转氨酶检脸试剂得反应原理如下:

a-酮戊二酸+1_-丙氨酸ALTL-谷氨酸+丙酮酸（初反

应）

丙酮酸+NADH+H+LDHL-乳酸+NAD+（主反

应）

NADH得氧化速率与样本中ALT酶活力成正比,NADH在340nm处有特征吸收峰,

在340nm处测其吸光度得下降速率即可计算出ALT得活性。

5、固定化酶得应用

5、1医药领域

固定化腺酶：腺酶就是专一性催化尿素水解得酶，应用于尿素生产控制、产品

检验，也广泛用于临床西学、医学检验等，腺酶得固定化在血液透析中有着极佳得

应用前景。

固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶得作用就是催化水解低密度脂蛋白上得磷脂得酶,

加速体内低密度脂蛋白得代谢。人体中得低密度脂蛋白就是主要得血浆胆固醇载

体，由于其在体内代谢缓慢，易形成高血浆胆固醉，以至引起心血管疾病，因比磷

酸酯酶得固定化可以应用于心血管疾病得治疗。

固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品得制备过程中产生得右

旋糖酉千。

5、2食品行业：

固定化酶应用于食品检测：固定化酶技术得发展使生物传感器也得到相当大

得发展，它不仅使食品成分得高选择性、快速、低成本分析测定成为可能，而且生

物传感器技术得持续发展将很快实现食品生产得在线质量控制，降低食品生产成

本，并可以保证安全可靠及高质量得食品。

5、3环境保护：

在环境监测方面，固定化酶也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。

杨雪梅等选用硅胶、活性炭、大孔树脂，在一定条件下用物理吸附法固定蛋白晦,3

种载体固定得蛋白酶炉含高浓度蛋白质得淀粉黄浆废水进行水解实验，发现大孔

树脂对蛋白酶得效果良好，并对含高浓度蛋白质得废水处理效果最好。在废水处

理中，固定化酶也受到了越来越多科学家得关注。生活污水与工业废水中有害成

分主要就是氯酚，将辣根过氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保证其100%得活力,

且净化效果就是粗酶得20多倍。

5、4生物传感器方面得应用：

在医学领域，生物传感器因快速、灵敏、专一、响应快等优点发挥着越来越

重要得作用。目前，在检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面生物传感器巳有

较广泛应用。比如高精度血糖分析仪就是采用固定化酶得生物传感分析仪，其分

析精度可以达到0、5%~2%,比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级，比目

前医用生化分析仪得精度也高2%~3%o这在血糖分析领域就是非常重要得［6］。

酶电极现已用于测定各种糖类、抗生素、氨基酸、有机酸、脂肪、醇类、胺类以

及尿素、尿酸等。

5、5能源利用：

近年来不少学者为了解决能源紧缺问题致力于利用固定化得脂肪酶催化合

成生物柴油。高阳等可究了利用多孔渗水物质为载体固定脂肪酶，使其可在低水

环境中合成生物柴油。氢气作为一种清洁能源已4起人们得关注。有学者利用聚

丙饰酰胺凝胶包埋丁酸梭状芽抱杆菌IF03847菌株，可以利用葡萄糖生产夏气，

并且稳定性好，无需隔氧

6、固定化酶得研究进展

固定化酶对提高酶得稳定性，拓展酶得应用领域具有非常重要得意义。目前

常用固定化方法普遍存在固定化使用试剂与载体成本高，固定化过程中酶得构象

受到影响及底物结合部位与活性中心受载体封闭所引起得酶活损失较大，固定化

操作过程繁琐等缺点，限制了固定化酶得产业化应用。针对当前固定化酶载体与

方法得不足，本文采用反相悬浮包埋法合成磁性琼脂糖微球，经环氧氯丙烷与亚

氨基二乙酸处理使微球带上螯合基团，经吸附铜离子后，制备了磁性琼脂糖一亚

氨基二乙酸（IDA）-Cu2+金属螯合载体，利用该载体定向固定了木瓜蛋白酶，固定

化最适条件为Cu2+1、5X10-2mol/g载体、固定化时间4h、固定化pH7、0、给

酶量30mg/g载体。固定化酶得最适反应温度70℃、最适反应pH8、0,固定化醮

得热稳定性明显高于溶液酶，固定化酶活力回收为68、4%,且有较好得操作稳定

性，载体重复使用5次后固定化酶酶活为首次固定化酶79、71%0本文研究了利

用金属整合载体固定多酚氧化酶时，固定化酶得性质。得出固定化酶得最适反应

温度为50℃,最适反应pH值7、0,固定化酶得酸碱耐受性明显好于溶液酶，固定

化酶反复使用6次，酶活仍保留50%左右，固定化载体可以反复使用5次，仍保持

良好得性能。在使用金属螯合载体固定化酶时，固定化反应条件温与，对酶得高级

结构影响小，酶活回收高；固定化酶得热稳定性明显提高；载体得再生、酶得固定

化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利用，固定化酶生产成本低。因此该

技术在工业上具有广泛得应用前景。

高分子微球具有一定得化学与机械稳定性，能抵抗微生物与酸碱得作用，就

是优良得固定化酶载体材料、针对制备高活性、高稳定性固定化酶对载体材料得

性能要求，评述了高分子微球得组成与功能性基团得可设计性、粒径与形态可控

性、多孔与大比表面积等结构性质，概括了载体结构性质对固定化酶催化活性

得影响规律，提出了对不同性质得生物酶”量体裁衣二设计制备特效得载体材料

就是高分子微球固定化酶研究得发展趋势、同时介绍了固定化青霉素酰化酶与固

定化脂肪酶在工业催化领域得应用、

首先用分相法与填充法制作了两种多孔玻璃微珠FXBL与TCBL,用它们作为

载体分别用物理吸附法、共价偶联法与重氮法固定了a-淀粉酶，在对它们得固定

效果比较后，选取了共价偶联法进行了较详细得研究；确定了共价偶联a-淀粉酶

得最佳固定条件、最佳应用条