植物细胞工程资料

植物细胞工程

名词解释

植物细胞的全能性就是植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息，具有形成植物有机

体所有细胞类型，直至发育成完整植物的固有能力。

形态发生就是生物个体发育或再生过程中，机体及其器官形态结构形成的过程。（包括器官

发生和体细胞胚胎发生）

再生作用是指植物进行无性繁殖中，在分离出根、茎、叶等i部分器官的过程中，切口处

组织会受到一定的损伤，在这些受伤的部位往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，从面

成为新的完整的植株。

植物决定取自生殖生长的外植体如花茎、花柄、苞叶等，已进入成花状态，在外源物质的

作用下可以直接分化花芽。这一现象不同于光周期或春化现象，成花决定主要受外源物质如

植物激素的种类和数量的控制。

（植物决定与植物全能性是两个不同的概念，前者是指植物发育过程中的阶段性事件，可能

与某•个或某些基因的打开与否有关，强调的是细胞的状态：而后者是说明组成植物个体的

细胞具备全套的与个体发育有关的基因，强调的是基因的数量。两者共同点都可利用离体培

养手段进行研究。）

脱分化是指外植体中已经分化的细胞，在切割损伤和培养物内外因素的作用下，逐渐丧失

其原有的分化的结构和功能，合成代谢变得旺盛、细胞壁由厚变薄，其内部结构也发生变化，

细胞高度液泡化，形成无组织的细胞团或愈伤组织。

愈伤组织在离体培养中，外植体切口受伤的细胞，在特定培养条件的作用下，细胞会发生

分裂而脱分化，经持续分裂增殖成具有分生能力的多细胞团，即愈伤组织。（致密型、硫松

型、衰败型）

拟分生组织通常称之为“生长中心”，是指愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，

在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群（一团小型、薄壁、液泡小、细胞核和细胞质染色

较深的细胞组织），具有分化上的可塑性。它们是愈伤组织中形成器官的部位。

胚状体离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管

培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。

污染凡混入培养环境中对组织和细胞生存有害的成分都应视为污染。

灭菌用物理或化学的方法，杀死物体表面和空隙内的一切微生物或生物体。

消毒指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。

综合题

一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配制室、接种室、培养室、观察室（细胞学

实验室）等。

培养基是外植体生长的营养物质，通常含有两个组成成分，即基本培养基和附加成分。

基本培养基是只含有无机营养成分和有机营养成分的培养基。常用的基本培养基近10~20

种。

完全培养基是在基本培养基的基础匕根据要求添加一些PGR和复杂的有机物质。

根据培养基凝固情况分为固体培养基和液体培养基

1.固体培养基加入了适量的凝固剂的培养基，如琼脂、卡拉胶、明股等。

2.液体培养基没有加入凝固剂的培养基，主要用于细胞的悬浮培养，抗褐化培养等。

培养基的成分主要可分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。

配置母液注意的问题：

应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。通常把每种试剂单独溶解后

再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。

混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca?+与S04?-和P0产错开，以免形成

硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。

常用的灭菌方法可分为物理和化学两类：

物理方法如干热（烘烧和妁烧）、湿热（常压或高压蒸汽）、射线处理（紫外线、超声波、微

波）、过滤等；

化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高镭酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、

酒精等化学灭菌剂。

无菌操作技术

一、接种前的准备

1.接种室内消毒保持定期用1%~3%的高锦酸钾溶液充■设备、墙壁、地板等进行擦洗，并

用甲醛熏蒸接种室。

2.洗手和着装接种员的头发、衣服、手指都不同程度地带有许多杂菌，先剪除指甲，用肥

皂洗净双手，最好再用02%新洁尔灭溶液擦洗或浸泡lOmin；在缓冲间换好专用实验服，

戴上帽子，并换穿拖鞋等；

3.培养皿、酒精灯和其他工具应事先放在超净工作台上，并用75%酒精擦洗或喷洒消毒。

工作台面上的用品要合理布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品放在左侧，

酒精灯置于中央。

4.在接种前打开超净工作台的风机，接种前用紫外灯照射2O-3Omin,接种室空间大的需用

30-50mino超净工作台也有紫外灯，主要用于消毒台面上用品，对台面流动的空气无意义。

紫外灯照射后15min,操作人员方可入内。

5.在使用期间用75%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使使空气中的细菌和真菌抱子随灰尘的沉

降而沉降。

6.上工作台后，经常用75%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。

7.超净工作台面要用0.2%新洁尔灭或75%酒精擦洗，使超净工作台对接种环境污染的控制

更有成效。

8.点燃酒精灯或煤气灯，先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镶了•和剪刀从头至尾过火•遍，

然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干。

9.工作人员的呼吸所产生的污染，主要是在接种时谈话或咳嗽所引起的，因此，在操作时应

禁止谈话并应戴上口罩。

高温处理和低温度理在植物组织培养中的作用有哪些？

高温处理（I）可获得无病毒苗，又影响到器官发生。草莓的茎尖分生组织经38c处理3~5

天，提高了无病毒茎尖分生组织的成活率。（2）热击可有效地减少内生菌污染。

低温培养（1）减轻褐化植物织培养中，如温度过高或过强，均可使PPO的活性提高，

从而加速被培养的组织褐变。（2）打破休眠在一些木本植物，如桃的胚培养中，一定时间

的2~5℃低温处理有利于提高胚的成活率。（3）脱毒。

褐化

褐化分为酶促褐化和非酶促褐化。酶促褐化必须具备酶、底物和氯三个条件。

原因：在自然条件卜，细胞中的酚和醍之间保持一种动态平衡，酚氧化酶类处于抑制状态，

酸类物质保持在一个较低的水平。在合适的pH、温度和水活性条件下，酚类物质、酚氧化

酶和氧气聚合在一起时发生氧化反映。当植物组织被切割、接种时的机械损伤或组织的老化、

病变使酚氧化酶激活，都会引起褐变。

减少褐化现象的措施：

1对母株的处理：

遮光，温室栽培，母株枝条用200mg/L6-BA处理。

2选择适宜的外植体

用植物的完整胚、叶片作外植体进行培养也很少发生褐变。外植体处于旺盛的生长状态，有

较强的分生能力，便可大大减轻褐化。

3切取外植体要求：

解剖刀必须尖锐，解剖刀的消毒不能过分灼烧。操作时动作敏捷，随切随接，以减少伤口在

空气中暴露的时间。

4对外植体预处理

（1）低温处理（2）高温处理（3）用抗氧化剂或吸收剂预处理（4）预培养

5选择适宜的培养基及培养条件：

改良MS培养基，低温、弱光照或暗培养有助于减轻褐化的程度。

6在培养基中加入抗氧化剂、PPO抑制剂或吸收剂

7连续转移外植体将外植体很快转移到新鲜培养基k2-3次，在某些情况下可以缓解褐

化，可能是在这段时间内外植体的切口逐渐愈合，外渗停止的原因。

植物组织培养中的污染与防止

（-）外源菌污染与防止

途径：1.空气传播：（1）接种室和培养室的空气是扩散微生物的主要途径。（2）涡流传播

摆放物品太多，无菌风吹过形成涡流群。

2.培养器皿和培养基培养器皿和容器洗刷不干净残留污染物，培养基消毒不彻底，培养基

放置时间过久积累灰尘，都可引入有害物。

3.人员与操作人员消毒不彻底，操作马虎，接种动作不准确，灭菌观念不强，封瓶口不严。

4.外植体消毒时间不够，含菌量多或体内带菌，难于灭菌。

5.培养过程污染组培瓶外和外界气体交换时，亦会有污染进入。

（二）细菌性污染

症状：培养基表面或培养物附近出现粘液状菌落，或浑浊的水迹状痕迹，或有泡沫的发酵状

情况。

污染原因：①污染菌类是零星分散在培养基中，原因：培养基灭菌时，高压灭菌锅末排尽冷

空气，灭菌压力不够，或温度不够，或持续时间不够；超净工作台长时间不换滤网，致使净

化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，手接触了外植体或器皿的

边缘，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；讲话或呼吸时排出

或头发洒落的细菌;接种室长期不灭菌，菌类太多。

②污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。原因：接种用具灭菌不彻底,

接种时材料被污染；未及时发现污染苗，接种过程交叉感染：若从培养基以下开始长菌，发

生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去

两个切口或虽剪但器具带菌。

防止对策：①培养基灭菌后在培养室放置2〜3天观察有无细菌感染的菌落；②接种前，剪

指甲，将手用肥皂洗干净，再用70%酒精擦洗；③避免交叉感染，工具用一次即需消毒一次；

④操作时，应戴消毒好的口罩和工作帽，穿消毒好的工作服，不要讲话。

（三）真菌性污染

污染原因：①接种室空气含真菌袍子；②瓶口边缘的灰尘；③取放瓶塞（盖）时扬起或由于

负压带入的灰尘和抱子。④人走动时，空气流通带入灰尘和抱子。

防止对策：①接种室经常处于工作状态，定期用40%甲醛和高镉酸钾进行熏蒸消毒；

②每次使用接种室和超净工作台先用紫外灯杀菌20min,紫外线能杀灭或抑制真菌生长，再

用70%酒精喷雾降尘；③用70%酒精擦洗容器外部，再放入超净工作台上；④接种时，

动作要轻，瓶子斜拿，瓶口放在火焰上，利用气流上升的原理，以阻止空气中泡子落入瓶内。

⑤保持室内较好采光，保存室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，梅雨季节晾晒工作衣

物，对减少室内真菌污染大有好处。

快速繁殖

快速繁殖就是应用植物组织和细胞培养的技术，快速繁衍珍稀濒危植物，使物种得以保存;

以及快速繁殖名优特新品种，使其在一定时间内繁衍为一定数量与母本相同的植株。也称离

体繁殖或微型繁殖。植物快速繁殖是植物生物技术的一个重要组成部分，这是因为它在生产

上起的作用最大，应用最为广泛。

特点：（1）繁殖速度快；12）节省土地；（3）可以培养无病毒苗；（4）繁殖成本较低

途径与方法：（1）无菌短枝型（遗传性稳定，速度快，主要方式之一）；（2）丛生芽增殖型

（球茎型：遗传性较稳定；块茎型：为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高；鳞茎型:

需时较长;根状茎型）；（3）器宜发生型（遗传的不稳定性，易变异，繁殖系数较低）；（4）

胚状体发生型（数量多，结构完整，易成苗，繁殖速度快，系数尚）；（5）原球茎型（遗传

性较稳定，可作为繁殖系母体）

初代培养，即接种某种外植体后，最初的1〜2代培养，旨在获得无菌材料和无性繁殖系。

固体培养

（1）优点：与液体培养相比，使用设备简单，操作简便，一般只要有培养室及接种箱即可

开展工作。对培养物的支持作用，通气问题易解决，便于经常观察研究等。

（2）缺点：培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散慢，影响养

分的充分利用；同时培养物排出的一曲代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。

故要及时转移培养。另外，组织受光不均匀，细胞生长就不一致。

继代培养把初代培养所获得的培养物，移植到新的培养环境，这种移植操作经过多次反复

的培养，就叫继代培养，又叫连续培养。

生根培养

生根的类型有试管内生根、试管外生根和微芽嫁接3种。

试管苗移栽到低湿条件下易于死亡的原因

试管苗由于是在无菌、有营养和GR供给、适宜光照和温度、近100%的相对湿度环境条件

下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。

1.叶片的结构与功能

（1）从叶片结构上看①试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛,

甚至叶片上出现了大量的水孔；②解剖结构稀疏，栅栏纽织不明显或薄；③气孔突起，气孔

口开张大；气孔的数量明显低于温室普通苗。

（2）从叶片功能看极易散失水分，气孔不能关闭且开张很大，叶片光合作用能力极低。

2.根的结构和功能

（1）从根的结构上看无或很少有根毛，如杜鹃、玫瑰的试管苗；有的根与输导系统不相通,

如在花揶菜、杨树、橡胶、杜鹃的试管苗中发现；一些木本植物的试管苗无根，如牡丹、瑞

香、苹果的试管苗等。

（2）从根的功能上看根的吸收功能无或极低。

植物生长调节剂对器官分化的调控模式

生长素/激动素＞1,有利于根的形成（也能促进不定芽的形成）；生长素/激动素＜1,有利于

茎芽的形成；生长素/激动素=1,促进愈伤组织的生长；促进腋芽的生长的不定芽的形成，

只需生长素或细胞分裂素的一种。

.影响遗传稳定性的因素（填空）

（1）基因型嵌合体经过组织培养后，其嵌合性更大；单倍体和多倍体比二倍体容易变异。

（2）有些植物取材部位不同，变异率不同

（3）增殖途径一般从茎尖、茎段、体细胞胚发生的植株变异率极低或不变异。通过愈伤组

织诱导再生的不定芽和悬浮培养，再生苗的变异率较高.

（4）继代次数一般随继代时间的延长，染色体变异频率增加。

（5）培养基中的激素成分如2,4-D可能是通过抑制纺锤体的形成，影响细胞内的某些

代谢过程，进而干扰了细胞的正常分裂，最终导致了染色体变异。

（6）其它培养条件如培养中长期使用抗生素、污染和衰老等。

茎尖培养？为何可脱毒？

茎尖培养是将植物顶端分生组织及其下方的1-3个幼叶原基部分取下培养成完整植株的技

术。

脱毒原理：（I）传导抑制病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织

中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的,专导。

（2）激素抑制在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平