高考生物-PCR技术的原理与实践应用（重难点训练）-含解析

专题06PCR技术的原理与实践应用

（5大常考题型+通关测试）

题组A真题探考向

1.（多选）（2025•河北•高考真题）X染色体上的D基因异常可导致人体患病，在男性中发病率为1/3500,某患病

男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染色体片段发生颠倒重接。研究者

对患儿和母亲的DNA进行了PCR检测，所用引物和扩增产物电泳结果如图。不考虑其他变异，下列分析错误的是

（）

正常X染色体及引物示意图

引物组合引物组合

S1和RI.S2和R2

A,A—

S2R2母亲患儿母亲患儿

注：引物组合S1和52,R1和R2可分别用于对正常基因D和H序处的力,增检测

A.该病患者中男性显著多于女性，女性中携带者的占比为1/3500

B.用R1和R2对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果相同

C.与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变

D.利用S1和S2进行PCR检测，可诊断母亲再次孕育的胎儿是否患该病

【答案】AB

【分析】分析题意可知，某患病男孩（其母亲没有患病）X染色体上的基因D和H内各有一处断裂，断裂点间的染

色体片段发生颠倒重接，故出现染色体倒位。

【详解】A、某患病男孩其母亲没有患病，可知该病为伴X染色体隐性遗传病，该病患者中男性显著多于女性，在

男性中发病率为1/3500,则该致病基因d频率为1/3500,正常基因D基因频率为3499/3500,女性中携带者的占比

为2x1/3500x3499/3500,A错误；

B、该男孩的母亲为携带者，基因型为XDXd,该男孩基因型为XdY,该男孩的染色体倒位，故用R1和R2不能扩增

出产物来，母亲有正常的H基因，有在物，故对母亲和患儿DNA进行PCR检测的结果不同，B错:吴；

C、该男孩的染色体倒位，故与正常男性相比，患病男孩X染色体上的基因排列顺序发生改变，C正确；

D、利用S1和S2进行PCR检测，有产物则含有正常D基因，若无产物，则含有致病基因，故可诊断母亲再次孕育

的胎儿是否患该病，D正确。

故选ABc

2.（2025・河北•高考真题）为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白

CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量

合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。回答下列问题：

⑴在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核昔酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是—和—。模

板与引物在PCR反应的一阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合所需耐高温，其原因为—„

（2）载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示,在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体

时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GPI两端应添加一（填两种限制

丽）的识别序列.用DNA连接前连接时，可催化载体和目的基因之间形成—键。

载体示意图

Nbe\Sma\EcoRV

拟构建整体的部分结构示意图：

I启动珍日历|CADR|GG/|丫五川终止子

限制酶中别序列及切割位点：

/VfeehcfcTAGC£coRljCikATTC

CGA呼CITA^J

XbaI:TLTAGAECORV：GAT^TCSmaI：CCCGGG

AGATCTCTATAGGGGCCC

图1

⑶若在荧光显微镜下观察到转基因衣蕖表现为一，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于

含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量一，则表明融合蛋

白能结合镉离子。

(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同福离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻

在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣濠的原因可.能是0240|Jm6・LT镉离子浓度下，转基因衣

藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是一。

W

芸

£

金

S品

1

镉离子浓度(网时!/)

图2

注：镉离子对渗透压的影响忽略不计

(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是—和—o

(填标号)

①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养

化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递

【答案】(1)脱氧核甘酸引物复性PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(90-95团使双链

DNA解旋为单链)，普通的DNA爽合酹在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活

性，保证PCR反应的正常进行。

(2)Sma回和EcoR0磷酸二酯键

⑶细胞表面发出黄色荧光高

(4)转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒需作用镉离子浓度过高，超出了

融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用

(5)①③

【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工

合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记

基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。

【详解】（1）在PCR反应中，原料是脱氧核甘酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少：引物在PCR过

程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少，所以分子数量逐渐减少的是引物和脱氧核甘酸。模板

与引物在PCR的复性阶段开始结合。在复性过程中，温度降低，引物与模板DNA单链的互补序到配对结合。PCR

中使用的DNA聚合酶需耐高温，是因为PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤（90-95回使双链DNA解旋为

单链），普通的DNA聚合睡在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酹能在高温环境中保持活性，保证PCR

反应的正常进行。

（2）观察图1,要避免偌误连接，GPI两端应添加Sma团和EcoRR的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐

个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nbe回

和Xba邮艮制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选•个，按照连接的顺序在将GPI连接到载体时

应该用SmaEl和EcoRH。DNA连接悔连接时，可催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，从而将载体和目的基

因连接起来。

（3）若在荧光显微镜下观察到细胞表面发出黄色荧光，初步表明融合蛋白表达成功，因为融合蛋白中有黄色荧光

蛋白YFP,其表达后会发出黄色荧光。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转

基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量高，则表明融合蛋白能结合镉离子。因为融合蛋白中的CADR可

吸附水体中的镉离子，若融合蛋白发挥作用，会使细胞壁镉离子含量升高。

（4）转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是转基因衣藻表达的融合蛋

白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用。240nmol.LT镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长

均被明显抑制的原因可能是镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用。

（5）转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是①和③。

①衣裸作为生物材料在水体中可自我繁殖，能够持续发挥作用：③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质，便

于后续处理，而化学药物可能存在二次污染等问题。

3.（2025•黑吉辽蒙卷・高考真题）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达

外源香树脂醇合酶基因N,高效生产香树脂醇。回答下列问题。

⑴可从中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒

PYL正确连接，需在引物1和引物2的5端分别引入和限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶

切后，利用连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒

pYL对应部分大小基本不变。

⑵进一步筛选构建的质粒，以1-4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，

结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有的

污染。初步判断实验组______（从“广4〃中选填）的质粒中成功插入了基因N,理由是。

⑶为提高香树脂醇合的催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位米丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基

序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱变序列），b、c、d其中一

条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还

有O

a：5-...GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC...-3'

b：5-...GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/A/XC/TAC/TTC/TCT/GAG...-3'

c：5-...GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC...-3'

d；5r...GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG...3r

⑷进一步检测转基因酵母菌发酵得到的含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。

【答案】（1）序列数据库Xho0Xba0DNA连接酶

⑵外源DNA1目的基因N大小为2.3kb

（3）GCC

⑷香树脂醇

【分析】PCR原理：在解旋能作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核甘酸为原料，

合成子堆，在引物作用下，DNA聚合前从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的S端自3,端延

伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3,

端延伸DNA链.PCR反应过程是：变件今复件T延伸.

【详解】（1）GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一，它的数据主要是各国的实验室、测序机构等发

布的序列信息。利用这个数据库，我们可以便捷地检索到基因和蛋白质的序列信息；故可从序列数据库中查询基因

N的编码序列，设计特定引物。保证基因N与质粒pYL正确连接，需要使用双酶切法，为了目的基因能正确表达,

目的基因需要插入质粒的启动子和终止子之间，且质粒和目的基因需要使用相同的酶或能产生相同黏性末端的酶；

分析图1可知，质粒pYL应该选用Spe团和Xho团酶切，由于目的基因N含有Spe团识别序列，故N基因不能使用Spe

国酶切，但Xba国与其具有相同的黏性末端，基因N酶切时可以用Xba团替换Spe氏即N基因两端应该含有Xba团和

Xh。团识别序列；题干信息：N基因a链为转录模板链，才有引物1和引物2扩增N基因，则扩增后模板链的'端含

有引物1序列，而编码链的5,端含有引物2序列，结合质粒pYL上的启动子和终止子方向，可知应该在引物2需要

5,端添加Xba0＞引物15,端添加Xho回识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段,

构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。

（2）构建重组质粒，大小约9.5kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变,

而质粒pYL本身7.2kb,可知目的基因N大小为2.3kb；分析电泳图可知，初步判断实验组1的质粒中成功插入了基

因N。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应体系是否存在污染，即检

验PCR反应中是否有外源DNA污染。

（3）编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA：

密码子位于mRNA上，mRNA上的序列与编码链序列相似，而a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物（GCA为诱

变序列），可知a引物延伸后的序列为编码链；b、c、d其中一条是诱变第243位苯内氨酸的引物，其配对模板与

a的配对模板相同，分析题图bed序列可知c是诱变第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列为编码链，

根据a引物5二端首位GCA为240位，则c引物'-端GCC为243位，故据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有

GCCo

（4）题干研究目的是通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇；由此可知，进一步检

测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较，可以选出最优的香树脂酸合酶基因的改造方案。

星组B

题型突破（HPCR技术中的引物

1.PCR引物设计是分子生物学实验中的关键环节，其质量直接影响到PCR的特异性和效率。下列相关说法错误的

是（）

A.GC含量会影响引物与模板结合的稳定性

B.引物的3,端可以添加限制酶识别序列，而5,端不可以

C.长度过短的引物，与模板链的结合力弱

D.引物自身及引物之间不可以存在互补序列

【答案】B

【详解】A、GC碱基对含3个氢键，比AT碱基对更稳定，GC含量高的引物与模板结合更牢固，A正确；

B、引物的引端必须严格与模板配对以确保DNA聚合酶延伸，而'端可添加限制能识别序列等额外序列，B错误；

C、引物过短会减少与模板的结合位点，降低结合特异性及稳定性，C正确；

D、引物自身互补会形成二级结构，影响PCR效率，D正确。

故选Be

2.目的基因A含有100对碱基，其中腺喋吟占30%,现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物区

用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（）

引物］II

引物n

目的基因A

A.PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代

B.含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共2$。个

C.PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都需要DNA聚合酶的参与

D.若只考虑目的基因A,经PCR循环50次需要鸟嚓吟（250-1）x40个

【答案】B

【详解】A、PCR的实质是DNA的半保留复制，该过程需经过高温变性、低温复性、中温延伸，PCR仪实质上是一

台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代，A正确；

B、含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，产生250个子代DNA,每个DNA分子需要2个引物，亲本DNA

除外，故需要两种引物共（251-2）个，B错误;

C、PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都是半保留复制，都需要DNA聚合酶的参与，C正确；

D、由题意可知，目的基因A含有100对碱基，其中腺喋吟占30%,则G占20%,为40个，若只考虑目的基因A,

经PCR循环50次需要鸟噪吟（250-1）x40个,D正确。

故选Be

3.下列关于PCR扩增DNA的叙述，错误的是（）

A.用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列

B.DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核甘酸

C.复性是在720左右使两种引物与模板链结合

D.引物序列过短，使PCR产物特异性较差

【答案】C

【详露】A、PCR扩增需要设计引物，引物需根据目的基因两端的已知序列设计，因此，用PCR方法扩增目的基因

时需要知道基因的部分序列，A正确；

B、DNA聚合酶只能从引物的3,端延伸DNA链，因该酶需结合到双链区并沿模板合成，B正确；

C、复性的温度通常为50团左右，此时引物与模板结合；72团是延伸阶段的温度，此时DNA聚合的催化合成新链，C

错误；

D、引物过短会导致与模板结合的特异性降低，易与非目标序列结合，使产物中出现非特异性扩增，D正确。

故选Cc

题型突破02利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式

4.目的基因和载体如果用同一种限制酶处理，连接时会出现正、反接的情况，为鉴定筛选出的表达载体中是否含

有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR后，结合电泳技术鉴定，图示为甲、乙、丙3条引物在正确

重组质粒中的相应位置，其中目的基因为长度300bp的片段。下列有关说法错误的是（）

A.>CR复性温度不宜太低，避免引物错配和模板链形成双链

B,电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关

C.选取引物甲、丙，扩增出450bp长度的片段时，可以说明目的基因正接

D.选取引物甲、乙，扩增出400bp长度的片段时，可以说明目的基因反接

【答案】Q

【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95。高温时变性会变成单链，低温（经常是6CTC左右）时引物与单链按碱

基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（7TC左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳

糖的方向合成互补链。基于聚合酹制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温

度之间很好地进行控制。

【详解】A、复性是在高温解旋后降低温度让引物与模板链结合，复性温度不宜太低，避免引物储配和模板链形成

双链，A正确；

B、电泳条带迁移的位置和速度与DNA分子的大小和构象有关，如电泳一段时间后，较大的DNA分子迁移距离小,

离加样孔近，而较小的DNA分子迁移距离大，离加样孔远，B正确；

C、由于使用的引物是甲和丙，没有与基因相应位置配对，因此不管基因正接还是反接，扩增片段的长度均为450bp,

C错误；

D、选取引物甲、乙，扩增出400bp长度的片段时，可以说明目的基因反接，D正确。

故选a

5.人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，现可以用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）.下图甲为获取的含

有目的基因（HSA基因）的DNA片段,Sau3AH、EcoR团、BamH团为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点;

图乙是三种限制酶的识别序列与前切位点示意图；图丙是土壤农杆函中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。请

回答下列问题：

启动子EcoRI

।—GAATFC-

EcconR1YTJAAG-Sau3AI

Ba/nHISau3AI0amHI

„.-GGATCC-

BamHLIIYCTAQG-终止r

Sau3MIII的基因IcQALGATC-

Sa”3AI-LAG-

EcoRIEa抗生素抗性基因

甲乙

⑴三种限制酶中能产生相同黏性末端的是；为了使目的基因与质粒定向连接，切割图甲所示DNA片段的

最佳方案是选用酶，所得重组质粒(填“能"、“不能"或"不一定能”)被BamH团切割。

⑵获取ISA基因还可以通过下列方式：首先采集人的血液，从中提取合成总CDNA,然后以CDNA为模板用

PCR扩增ISA基因。与基因组文库获取的目的基因相比，利用CDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其基因结构的

特点是不含。

⑶生物技术的发展和应用使利用动物生产人的血清蛋白成为可能，下图是上海某研究所培育生产出血清蛋白奶牛的

流程，请据图回答。

雌性奶牛人体血消

胚胎细胞蛋白基内

基因导入

重组细胞1

旗组细胞1的核去核牛卵细胞

Y

重组细胞2

用期胚胎

母牛1母牛2母牛3

子宫子宫子宫

妊娠、出生

小牛1小牛2小牛3

①为了获得大量早期胚胎，可对囊胚进行分割，此时要注意将均等分割。胚胎移植的实质是。

②在进行性别鉴定时，需要取囊胚的细胞做DNA分析。据图分析，小牛1、2、3的性别是性。

【答案】⑴BamHPl和Sau3A团BamH团和EcoR团不一定能

(2)mRNA非编码区(启动子、终止子)、内含子

(3)内细胞团早期胚胎在相司生理环境下空间位置的转移滋养层雌

【分析】基因工程技术的基本步骤：

1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将忖的基因导入植物细胞的方法有农杆

菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将巨的基因导入微生

物细胞的方法是感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定：

(1)分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因一一DNA分子杂交技术；②检测目

的基因是否转录出了mRNA一一分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一一抗原-抗体杂交技术。

（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

【详解】（1）根据图乙分析可知,Sau3A0、EcoRSsBamH国三种限制酶，产生相同黏性木端的是BamH团和Sau3AI3,

其黏性末端为（-GATC-）；结合图甲分析可知，Sau3AI2会破坏目的基因，应该选择EcoR用和BamH①切割图甲所示DNA

片段。质粒上含有EcoRI3、Sau3A。的识别位点，Sau3A13与BamH团酶的识别序列不一定相同，故所得重组质粒后，不

一定含有BamHEI的识别位点，所得重组质粒不一定能被BamH团切割。

（2）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。首先采集人的血液，从中提取

mRNA合成总cDNA,然后以cDNA为模板用PCR扩增HSA基因。利用cDNA作为导入大肠杆菌的目的基因，其特点

是不含启动子（和终止子）、内含子等。

（3）①对囊胚分割时，要注意将内纽胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。胚胎移植的

实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，供体和受体需处于相同生理状态，便于胚胎存活发育。

②进行性别鉴定时，可取囊胚的滋养层细胞做DNA分析，因为滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，取其细胞不影

响内细饱团发育成个体。分析流程可知，小牛32、3来自同一早期胚胎，遗传物质相同，而提供核的是雌性奶牛

胚胎细胞（含XX性染色体），所以它们的性别是雌性。

题型突破03PCR技术引导基因定点突变

6.蛋白质工程中可以利用引物引导的方法对DNA进行定点突变，进而改变蛋白质的特定氨基酸。图为这种定点突

变方法的实验流程。（在细菌体内合成的DNA分子有甲基化修饰，通过PCR扩增的DNA链无甲基化修饰），下列叙

述错误的是（）

大量突变侦粒

（含有缺口）

少量未突变质粒模板

A.要改造蛋白质应首先从设计控制该蛋白质的基因的脱氧核昔段序列出发

B.雷白质工程的实质是通过改造或合成基因来改造现有蛋白质或制造一种新的甯白质

C.羽中用于突变的两条引物之间能发生碱基互补配灼

D.限制酶能识别质粒中发生甲基化的位点，待突变质粒的甲基化修饰不会影响PCR扩增

【答案】A

【4析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造

现有蛋白质，或合成一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。

【详解】A、要改造蛋白质应首先从预期蛋白质的功能出发，设计预期蛋白质的结构，推测应有的氨基酸序列，找

到并改变相对应的脱氧核甘酸序列或合成新的基因，最终获得所需要的蛋白质，A错误。

B、蛋白质工程的目标是按照人们对蛋白质功能的特定需求对蛋白质的结构进行分子设计，由于基因决定蛋白质，

因此对货白质的结构进行设冲改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，B正确：

C、由图可以看出，用于突变的两条引物之间在第三、四幅图（从左往右）中都进行了碱基互补配对（成环、且挨

得很近），C正确；

D、甲基化修饰属于表观遗传的一种，并不改变基因的碱基序列，只会影响基因的表达过程，不会影响基因的复制，

由图可以看出，经限制酶切割后，被甲基化修饰的待突变质粒模板被切割（第四幅图虚线的环），所以图中所示限

制酶能够识别质粒中发生甲基化的位点；PCR扩增的实质就是DNA在体外进行的复制，所以待突变质粒的甲基化修

饰不会影响PCR扩增，D正确。

故选A,

7.利用重叠延伸PCR技术可对基因进行定点突变，如图为相关过程，下列叙述错误的是（）

拟突变位点

突变后的基因

A.为获得产物甲，过程②至少循环2次

B.过程②和过程③不可以在同一体系中进行

C.过程④中，杂交延伸无需添加引物

D.若突变后基因扩增30轮，则消耗引物2打个

【答案】D

【分析】PCR是聚合的链式反应的缩写，是一项在生物体外亚制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可

以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核甘酸）、酶（耐高温的DNA聚

合酶），PCR反应过程是：变性1复性3延伸。

【详解】A、获得产物甲需要用引物1和2扩增，扩增一次时，引物1延伸的子链与亲代模板链等长，该DNA不符

合要求，且该DNA经过第一次复制后得到的两个DNA也不符合要求，扩增一次时，引物2延伸的子链比亲代模板

链短，该DNA不符合要求，但该DNA中引物2所在的子链在第二次复制后可形成产物甲，因此为获得产物甲，过

程②至少循环2次，A正确；

B、过程②和过程③需要扩增的产物不同，且引物2和引物3存在互补的碱基，因此过程②和过程③不可以在同

一体系中进行，B正确：

C、过程④中两条DNA链部分碱基互补，每条链都可以为另一•条链的延伸提供模板，且每条链的3,端都打以向后延

仲，因此杂交延伸无需添加引物，C正确；

D、DNA复制为半保留复制，每条新形成的子链中都含有引物，若突变后基因扩增30轮，则新形成的子链为230x2

—2=231—2,D错误。

故选D。

题型突破04利用重叠延伸PCR技术构造融合基因

8.（多选）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，

从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。图示为利用融合PCR技术构建CMP-GFP融合基因的基本过程（CMP

为黄瓜花叶病毒运动蛋白基因，表达产物参与病毒在细胞间的转移；GFP为绿色荧光蛋白基因）。相关叙述正确的

是（）

CMP基因GFP基因

引物1引物3

I转录方向~►T

梅切位点CMP-GFP融合基因梅切位点

A.除图示外，融合PCR还需dNTP、解旋酶以及含Mg2+的缓冲液等

B.引物1需添加限制酹识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列

C.重叠延伸时•，两条链分别为a、d或b、c,两者互作模板和引物

D.CMP-GFP融合基因在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径

【答案】BD

【分析】重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重

叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术。

【详解】A、除图示外，融合PCR还需dNTP、以及含Mg2+的缓冲液等，但不需要解旋酶，A错误；

B、引物1需添加限制酶识别序列，引物2需添加与引物3部分互补的序列，从而为融合基因基因的形成提供引物，

B正确；

C、重叠延伸时，两条链分别为a、d,两者互作模板和引物，实现融合基因的扩增过程，C错误；

D、CM)一GFP融合基因中含有绿色荧光蛋白基因，其在受体细胞中表达可追踪病毒在细胞间的转移途径，D正确。

故选BDo

9.金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SEIK)可促进人体免疫应答，诱导淋巴细胞释放细胞因子。为研究SEIK作用机制，科

研人员利用重叠延伸PCR和无缝克隆技术构建了携带SEIK和GFP(绿色荧光蛋白)融合基因的工程菌，部分过程如

下图。请回答下列问题。

SEIK-GFP

融合蛋白

分离|

t

大肠杆菌

同源序列1：5—ACGAGTGGATCACTC-3^

同源序列2:5^—AACATAGACATGTGC—3Z

(l)PCR的原理是oPCRIH,发性温度过高会影响,从而导致目标产物减少。

⑵研究发现，SEIK基因和GFP基因的编码链(非模板链)碱基序列分别为：

5'-AAGGTGATATAGGAA......AGAGCCACCTCCGCC-3'

S,-TGAACCGCCTCCACC......GGCATCGACGAGCTG-3Z

则在PCR1反应体系中加入的引物Fi、Ri分别为、(从①〜④中选填)。

序号引物碱基序列

①5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3'

②5'-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3'

③5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3'

④5'-AACATAGACATGTGCAAGGTGATATAGGAA-3'

⑶无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是o过程①中，T5核酸外切酶水解脱氧核甘酸链的长度应大

于同源序列长度，目的是°过程③所需的能有。

⑷构建的表达载体通常经(方法)进行鉴定与验证。将转化后的大肠杆菌接种于含的选择培

养基中培养，一段时间后再挑取的菌落纯化培养。

⑸为检测SEIK-GFP融合蛋白的生物活性，科研人员分别对小鼠注射缓冲液、SEIK溶液、GFP溶液和SEKGFP溶液,

定时测定小鼠体内干扰素，(IFN-v)含量，结果如图。

I

F

N

Y—

/

p

g

.

m

r

②研究表明，可利用S曰KCFP融合蛋白研究SEIK作用机制，依据是,且能对SEIK的作用进行定位追踪。

【答案】(1)DNA半保留复制引物与模板链结合

(2)@③

⑶磷酸二酯键使同源序列间能完全互补配对DNA聚合酶和DNA连接酶

(4)(酶切或PCR、)电泳卡那霉素绿色荧光强度高

(5)证明GFP对小鼠体内干扰素-Y的释放量无影响SEIK-GFP融合蛋白生物活性并未明显改变

【分析】PCR由变性•退火-延伸三个基本反应步骤构成：

(1)模板DNA的变性：模板DNA经加热至90团左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA

解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作准备。

(2)模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50回左右，引物与模板DNA单链

的互补序列配对结合。

(3)延伸：DNA聚合的由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合陶。该

步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成II勺DNA片段长度。

【详解】(1)PCR的原理是DNA半保留复制。PCR时，复性温度过高会影响引物与模板链的结合，复性是指在一

定温度下，引物与模板DNA单链通过碱基互补配对结合的过程，若温度过高，引物与模板链无法有效结合，就会

导致后续的延伸过程无法正常进行，从而使目标产物减少。

（2）在PCR1反应体系中，是对SEIK基因进行扩增，引物的作用是与编码链的3,端互补配对，引导DNA聚合酶进

行子链的合成，已知SEIK基因的编码链碱基序列为S'-AAGGTGATATAGGAA……AGAGCCACCTCCGCC-3',对应的互补链

为3'-TTCCACTATATCCTT......TCTCGGTGGAGGCGG-5',引物F1是用丁扩增SEIK基因的编码链的引物，应与SEIK基因编

码链的互补链的土端结合，所以与编码链的5,端部分序列相同且添加了同源序列1（5，-ACGAGTGGATCACTC-3'），所

以F1为S-ACGAGTGGATCACTCAAGGTGATATAGGAA-3',即②，引物R1是用于扩增SEIK基因的非模板链的引物，应

与SEIK基因非模板链3,端部分序列互补，而非模板链的序列为S^TGAACCGCCTCCACC……GGCATCGACGAGCTG-3，,所

以R1为S'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT-3',即③。

（3）无缝克隆时，T5核酸外切酶作用的化学键是磷酸二酯键。过程①中，T5核酸外切酹水解脱黛核甘酸链的长度

应大于同源序列长度，目的是使融合基因两端露出足够长度的同源序列，以便在后续过程中能够使同源序列间能完

全互补配对。过程③是将线性化载体和目的基因连接形成重组质粒的过程，所需的酶有DNA连接酶和DNA聚合酶，

DNA连接酶可以连接DNA片段之间的磷酸二酯键，DNA聚合酶可以填补可能存在的缺口。

（4）构建的表达载体通常经（酶切或PCR）电泳进行鉴定与验证，PCR可以检测目的基因是否存在，酶切可以验

证载体和目的基因的连接情况，电泳可以检测目的基因的条带大小是否正确。由图可知，表达载体中含有卡那霉素

抗性基因，所以将转化后的大肠杆菌接种于含卜那霉素的选择培养基中培养，只有成功导入表达载体的大肠杆菌才

能在该培养基上生长，一段时间后再挑取绿色荧光强度高的菌落纯化培养，因为构建的是携带SEIK和GFP融合基因

的工程菌，绿色荧光强度高说明成功表达了融合蛋白，即成功导入了目的基因。

（5）①实验中设置GFP溶液组作为对照，因为SEIK-GFP融合蛋白中有GFP部分，设置GFP溶液组可以排除GFP

本身对小鼠体内干扰素-Y（IFN-Y）含量的影响，即证明GFP对小鼠体内干扰素呷的释放量无影响。

②观察可知，注射SEIK-GFP溶液组与注射SEIK溶液组小鼠体内干扰素-v（IFN-v）含量变化基本一致，这表明SEIK-GFP

融合蛋白能发挥与SEIK相同的作用，即SEIK-GFP融合蛋白生物活性并未明显改变，可利用SEIK-CFP融合蛋白研究

SEIK作用机制，且由于GFP具有荧光特性，能对SEIK的作用进行定位追踪。

10.重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠

链的延伸，将不同来源的扩增片段重登拼接起来的技术。某科研小组从猪源大肠杆菌中扩增得到J'LTB基因和STI

基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB—STI融合基因，其过程如图1所示。

LTB基因ST1基因

弓

iPCR扩增产物回收M123

—7500bp[=-----------------

目的链L=■目的链S5OOObp一

2500bp——

杂交

倭

lOOObp——

25Obpl—____________|

M表示标准对照基因

1、2、3表示不同DNA电泳结果

图2

⑴利用PCR技术扩增LTB基因和STI基因的过程中，向反应体系中加入的物质除了引物和模板链，还需要加

入、oPCR过程中，使DNA解旋的方法是。

（2）设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列（填“能"或"不能"）互补：引物P2与引物P3的碱基序列―

（填"能"或"不能〃）部分百补°从引物P2和引物P3的角度分析，LTB基因的PCR过程与STI基因的PCR过程不能在

同一个反应体系中同时进行，原因是o

（3）DNA了链是从其卜端向3,端延伸的。为了使重叠链顺利延伸，LTB基因与STI基因的PCR过程至少需要进行

次循环才能得到目的链L、So目的链L、S构成了杂交链。在杂交链延伸生成LTB-STI融合基因的过程中，（填

“需要”或"不需要”）加入引物。在下图中的小方框内标出杂交链两条母链各自的3,端和5,端一。

（4）科研小组为了检测是否成功构建出LTB-STI融合基因，将反应后体系中的各种DNA分子进行电泳，结果如图2

所示。则LTB-STI融合基因最可能是（填“1〃或“2”或"3"）,判断依据是。

（5）获得LTB-STI融合基因后，若要大量扩增该序列，可选择图中引物继续进行PCR。

【答案】（1）耐高温的TaqDNA聚合酶4种脱氧核甘三磷酸（dNTP）高温（或90—95（3）处理

（2）不能能弓I物P2和引物P3之间能结合，会干扰弓物和模板链的结合，影响PCR过程

3'5,

⑶2不需要53'

（4）3LTB-STI融合基因包含2个不同的基因，其分子量较大，3表示的DNA分子量最大（或1和2与M

中碱基对数为lOOObp和2500bp的对照基因的电泳结果相同，3的碱基对数大约是1和2的碱基对数之和）

⑸引物P1和引物P4

【分析】PCR原理：在解旋睡作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱黛核甘酸为原料，

合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3,端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5,端自3,端延

伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的豆制过程。DNA的豆制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3,

端延伸DNA链。

【详解】（1）PCR体系中需要加入的物质有引物、模板链、耐高温的DNA聚合酶和dNTP（作为原料）等；PCR

是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术扩增目的基因，依据的生物学原理是DNA双链复制，该过程中DNA双

链解开是通过高温（或90—95团）处理实现的。

（2）LTB和ST1基因能够融合的关键是P2和P3两种引物的部分区域能发生碱基互补配对，碱基互补配对区域的

碱基之诃能够结合在•一起，从而将两个基因融合在一起；由于P2和P3两种引物能结合，因此PCR1和PCR2不能在

同一个体系中进行，因为引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从