第1章 发酵工程（答案版）

第一章发酵工程

第1节传统发酵技术的应用

发酵工程：是指利用微生物的特定功能,通过现代工程技术,规模化生产对人类有用的产品，它涉及菌种

的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。

一、发酵与传统发酵技术

1.发醐的历史：约9000年前，我们的祖先就会利用微生物将杳物、水果等发醉成含酒精的饮料。

2.1857年，法国微生物学家巴斯德通过实验证明，酒精发酵是由活的酵母菌引起的。

3.由于不同的微生物具有产生不同代谢物的能力,因此利用不同微生物，通过发酵就可以生产出人们所需要

的多种产物。

(1)发酵的概念：人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物

的过程。

(2)发酵类型

.好氧发酵：醋酸发酵

厌氧发酵：酒精发酵、乳酸发醉

4.发酵原理：不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力,因此利用它们既可以生产出人们所需要的多种产

物。

5.传统发酵技术的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物,或利用前一次发酵保存下来的发酵物中的微

生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。

6.腐乳的制作

(I)参与的微生物：多种微生物参与了豆腐的发酵，如酵母、曲霉和毛霉等,其中起主要作用的是毡。

(2)腐乳的特点：经过微生物的发酵,豆腐中的蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸,味道鲜美，易于消化

吸收，便于保存。

7.传统发酵技术

(I)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物,或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微

生物进行发酵、制作食品的技术。

⑵特点:：传统发醉以混合菌种的固便发酵及生固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。

(3)发酵产品：利用传统发酵技术制作的食品有鹿乳、餐、鳌浊、醒、泡菜和豆豉等,它们是我国传统饮食

文化的重要组成部分。

8.使用酵母制作馒头属于传统发酵技术吗？

不属于，使用前一次发酵保存下来的面团进行的才算；例如直接利用空气中毛霉胞子制作腐乳属于传统发

酵技术，若直接接种毛霉，则不属于。

二、尝试制作传统发酵食品

1.相关菌种

（1）乳酸菌

①分布及常见菌种：乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。

②代谢及反应式：乳酸菌是厌氧（需氯、厌氧、兼性厌氧）细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸,

反应简式为：C6H]2O6-BT2c3H（乳酸）+能量。

③生产应用

可用「一乳制品的发酵一、.泡菜的腌制一等

④分布

空气、.土壤、植物体表、一人或动物的肠道内.

（2）酵母菌

①分布：酵母菌是一类单细胞真菌，在一些含搪量较高的水果、蔬菜表面经常可以发现酵母菌的存在。

②代谢及反应式：酵母菌能以多种糖类作为营养物质和能量的来源，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件

下，酵母菌进行有鱼呼吸，大量繁殖，反应式为：GH12（h+602+著~>6COz+12H2O+能量;在无

氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，反应式为：CHIZOG-ST2c2%OH（酒精）+2C（h+能量。

③应用及影响因素：酵母菌可用于酿酒、制作馒头和面包等。温度是影响酵母菌生长的重要因素，酿酒酵

母的最适生长温度约为2fC。

（3）醋酸菌

①代谢及反应式：醋酸菌是好氧细菌，当氧&糖遮都充足时能将糖分解成醋酸，反应式为：C6旦

2O^~>2CH3COOH（醋酸）+2IW+2C6+能量:当缺少糖源时则将乙醉转化为乙醛，再将乙醛变

为醋酸，反应式为：C2H5OH+6-BTCH3COOH（醋酸）+H?O+能量。

②应用及影响因素：醋酸菌可用于制作各种风味的醋。多数醋酸菌的最适生长温度为迎口

三、探究.实践一：泡菜的制作

1.制作泡菜

（1）菌种的来源:制作传统泡菜是利用植物体表面天然的乳酸菌来进行发酵;发酵期间，乳酸会不断积累,

当它的质量百分比为0.4%.0.8%时,泡菜的口味、品质最佳。

（2）制作泡菜发酵条件:适宜的温度、严格控制厌氧条件。

（3）制作泡菜方法步骤:配制盐水->蔬菜装坛一加盐水一封坛发酵

①配制盐水:用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水.并将盐水煮沸，冷却待用。

②蔬菜装坛:将新鲜蔬菜洗净、切成块状或条状，混合均匀.晾干后装坛,装至半坛时.放入蒜瓣、生姜、及ITA香

辛料，继续装至八成满，

③加盐水:将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过全部菜料。

④封坛发酵:盖好坛盖,向坛盖边沿的水槽中注满水，发酵过程中注意补充水，根据室内温度控制发酵时间。

2.制作泡菜实验分析

（1）盐的相关分析

①盐的作用：调味，抑制其他微生物生长及调味。

②盐水浓度为质量百分比为泌迫区。

③盐水浓度要适宜的原因：盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳

酸菌死亡；过低，杂菌易繁殖，导致泡菜变质。

④盐水煮沸的目的：杀菌，去除水中的溶解氧。

⑤盐水冷却后使用的目的：为了不影响乳酸菌的生命活动（为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受膨响）。

（2）相关气密性的分析

①泡菜坛子使用之前要检查密封性的0的：给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件，利于乳酸菌发

骼

②用水密封泡菜坛的FI的：给泡菜坛内创造无的环境，严格控制厌氧条件。

③泡菜坛应装至八成满？为什么？防止由于产生CO2而导致发酵液溢出坛外（初期大肠杆菌、酵母菌会产

生）防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂。

（3）在冷却后的盐水中可加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。

（4）泡菜制作过程中，是否只有乳酸菌起作用？不是，还有一些酵母菌和大肠杆菌。

（5）蔬菜应新鲜的原因：若不新鲜，蔬菜中的亚硝酸盐含量会升高。

（6）为什么含有抗生素的牛奶不易发酵为酸奶？

牛奶发酵为酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌。

（7）泡菜坛的发酵液表面会长出一层白膜，这层白膜是乳酸菌吗？

不是，是酵母菌繁殖形成的，因为表面氧气含量丰富，不适于乳酸菌生长。

（8）制作泡菜过程中，保证坛内乳酸菌发酵所需无氧环境的操作是：装坛时盐水没过全部菜料，向坛盖边

沿的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水。

四、探究.实践二：制作果酒和果醋

（一）制作果酒：

1.参与发酵的主要微生物及来源：—新鲜水果的果皮表面附着的野生酵母菌；

2.发酵原理

①许多一新鲜水果的果皮表面―附着有大品的不同种类的一野生酵母菌_：

②在这些酵母菌的作用下，水果可以发酢成果酒（通过有氧呼

+

C6II12O6+6O26H2O6C02+121l20+^fi

2c2H50H（酒精）+2C（）2+能量

见大量繁殖，通过无氧呼吸产酒精）:

③相关反应式

3.发酵条件：

①温度：将温度控制在进行发酵；

②氧气含量：氧气充足的情况下，大量繁殖；无氧条件下，在行酒精发酵;

4.制作流程：

器具消毒将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒,

।j~晾干备用

冲洗前葡取新鲜前葫，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥十

用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间）,

盖好瓶盖

将温度控制在18-30℃进行发酵,在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点

（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶打。发酵时间为10T2d.

------------可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测

果酒检测------------------------------------------------------------------------------

（二）制作果醋：

1.参与发酵的主要微生物及来源：空气中的醋酸菌或人工接种的醋酸菌一;制作果醋所利用的菌种属J'M

核生物,与酿造果酒所需菌种相匕较，该菌种在细胞结构上的主要特点是没有以核膜为界限的细胞核（没有

成形的细胞核）。

2.发酵原理

①在的条件下，果酒经醋酸菌的作用可以进一步发酵成果醋_；

②当糖源充足时，醋酸菌还可以直接将糖分解为醋酸：

③相关反应式

C21150H+。2CII3C（）0II（醋酸）+H2（H能量

2CH3COOII（醋酸）+2H2O+2CO2+能量

3.发酵条件:

①温度：发酵温度为30・35七：

②氧气含量：氧气供应一充足.

以乙醇为底物的类型为例)

臭酒制作

山

打开瓶盖，盖上纱布当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖,盖上一层纱布,进行葡萄晴的发酵。

发酵温度为亚坦2,时间为堂九

果醋检测

5.制作果酒实验分析：

⑴用体积分数为70%的酒精给发酵瓶、榨汁机消毒。

(2)冲洗葡萄的目的：去除表面灰尘、污物。

(3)冲洗1-2次即可，能否连续冲沆？为什么？不能，防止果皮表面的野生菌种数量减少。

(4)去梗之前冲洗还是去梗之后冲洗？之前。为什么？避免葡萄破损，减少被杂菌污染的机会,

(5)葡萄汁装入发酵瓶时，能装满吗？不能，要留约1/3的空间。为什么？a.先让酵母菌进行有氧呼吸，快

速繁殖，耗尽02后，再进行酒精发酵;b.防止发酵过程中产生的CCh造成发酵液溢出。

(6)每隔12h左右将瓶盖拧松一点这样做的目的是的目的：排出气体(CO?)。但又不打开，此后再拧紧目的

是防止氧气和有害杂菌进入c

⑻果酒制作过程中，在不灭菌的情况下，酵母菌是如何成为优势菌种的？发酵后期在缺氧和酸性发酵液中,

绝大多数微生物的生命活动受到抑制，而酵母菌可以适应这一环境成为优势菌种。

(9)在制作果酒过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，

如何避免这种影响？还有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能将糖分解为甘油、酒石酸等，从而使果酒变质，

而在有氧的情况下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇转化为乙醛进而转化为醋酸。可以通过调节发酵

的温度、pH等来控制乳酸菌含量；可以通过减少O?含量、调节发酵温度、pH来控制醋酸菌含量。

(10)如何检测果酒的发醉情况:闻、品尝、用酸性重络酸钾溶液检测(橙色-＞灰绿色)。

(11)葡萄酒呈现深红色的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的色素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红色。

(12)果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变，CO?也不产生，原因可能是原料耗尽或高浓度的酒精抑

制了酵母菌细胞呼吸。

6.制作果醋的实验分析

（1）在制作果醋的过程中，酵母菊是否还会继续发酵？随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等

均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低，不会继续发酵。

（2）醋酸菌从何而来？打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入果酒发酵液中大量繁殖，其他的茵因不适应环

境条件（不能利用乙醇）而不能繁殖。

（3）采用什么措施可以加快果醋的制作？在工业上，后期醋的发酵需要人工接种醋酸菌；或者买一瓶醋,

将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜（即醋酸菌膜），用这层薄膜进行接种亦可。

（4）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止发酵液被污染？

a.发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用;

b.处理葡萄时应先冲洗再去除枝梗：

c.排气时只需拧松瓶盖，不要打开瓶盖。

（6）如何检测果醋的发酵情况？

闻、品尝、使用DH试纸检测检测和比较发酵前后的DH值、观察醋酸菌膜是否形成。

第2节微生物的培养技术及应用

微生物是难以用肉眼观察的微小生物的统称,包括细菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微

生物主要指用于发酵的细菌和真菌。

一、微生物的基本培养技术

1.防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提（即发酵工程的重要基础）。

2.在实验室培养微牛.物：一方面：为微生物提供合适的营养和环境条件（培养基）。另一方面：要确保其他

微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来（尢菌技术）。

（一）培养基的配制

1.培养基概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

2.培养基作用：用以培养、分离、鉴定、保左微生物或积累其代谢物。

3.培养基的分类（按照物理性质分类）

（1）液体培养基：不含凝固剂（如琼脂）,呈液体状态.

用途：扩大培养获得大量菌种、常用于工业生产。目的是增加目的菌的数量。

（2）固体培养基：含凝固剂（如琼脂），呈固体状态。

用途：分离、计数、鉴定等。

5.培养基的基本成分：

（1）成份：各种培养基•般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对ML

特殊营养物质以及正的需求。如培养乳酸菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌（真菌）时需将培养基

调至酸性,培养细菌时需将培养基调至中性或弱碱性,培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。（2）微

生物培养基需要氮源，这是因为：氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。下表是某微生物培

养基的成分，该培养基可用来培养且养（自养、异养）型微生物。若除去①，此培养基不能（能、不能）

培养圆褐固氮菌，原因是：圆褐固氮菌虽可以固氮，但其同化作用类型为异养型，培养基中必须提供含碳

有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌。

编号©②③④⑤

成分

(NH4)2SO4KH2PO4FCSO4CaCbH2O

含量/g0.44.00.50.5100mL

4.如何将液体培养基制成固体培养基？加入适量琼脂。

6.实验室中最常用的培养基之一：琼脂固体培养基。

7.微生物在琼脂固体培养基的表面或内部生长,可以形成菌落。

9.牛肉膏和蛋白陈来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质,蛋白腺提供的主要营养为氮源、

维生素。牛肉膏提供的主要营养为碳源、磷酸盐、维生素。

10.含C、H、0、N的有机物可作为异养型微生物的碳遮、氮遮、能源。

11.刍养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于碳遮。

12.能否根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型？理由？可以，例如自养型微生物所需的碳源来自无

机碳源，异养型微生物所需的碳源来自有机碳源。

12.无机氮源能给自养型微生物提供能源吗？理由？可以，例如NH3既作为硝化细菌的氮源，也作为能源

（NH3氧化释放的化学能）。

13.无机盐除了可以调节酸碱平衡、维持一定的渗透压之外，还能有什么功能？有些无机盐离子可以作为化

能合成菌的能源（如铁细菌）。有些无机盐离子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）

14.是否所有培养基中都必须添加碳源、氮源？不是，例如分离固氮菌不需要额外添加氮源，其可以直接利

用空气中的氮气。

二、无菌技术

1.获得纯净的微生物培养物的关键：防止杂菌污染。无菌技术应围绕如何避免杂菌的污染展开。

无菌技术主要包括消毒和灭菌。

2.无菌技术（消毒和灭菌）工作主要包括两个方面：

⑴对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。

⑵对用于微生物培养的瞿皿、接种用具和培养基等进行灭菌。

3.做好消毒灭菌工作后，要注意：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。

4.为避免周围环境中微生物的污染，应如何操作？在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行.

5.无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,无菌技术还能有效避免操作者被微生物感

染。为达到后一目的，操作者在实验室中不可吃东西、喝水,离开实验室时一定要洗手。另外，为避免

污染环境，我们对使用后的培养基丢弃前一定要进行礼菌处理。

6.消毒：

（1）概念：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。

（2）方法:煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物。

a.日常生活中经常用到煮沸消毒法,操作方法：100℃煮沸5~601m；

b.对于一些不耐高温的液体如牛奶，可使用巴氏消毒法,操作方法：62〜65c消毒30min或80〜90C消毒

30s-1min；

c.生物活体、水源等还可使用化学药物进行消毒,操作方法：用迺精擦拭双手、用氧气消毒水源等；

d.接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射,操作方法：紫外线照射30min。

7.灭菌：

（1）概念：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽抱和洵子。

（2）方法:湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌。

a.培养基等一般用湿热灭菌法,湿热灭菌是一种利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法,其中高压

蒸汽灭菌的效果最好,操作方法：高压蒸汽灭菌锅内.lOOkPa,温度121c.i5〜30min。

b.耐高温的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）、金属用具等，可以用干热灭菌法,操作方法：

物品放入干热灭菌箱,160〜170℃加热2〜3h°

c.接种过程中，微生物的涂布器、接种环、接种针或其他金属用具、试管口、瓶口通过灼烧灭菌法来灭菌,

操作方法：直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。

9.酒精消毒的最适范围是体积分数为70%.75%的酒精。原因：酒精浓度过高时，菌体表面蛋白质变性过快，

从而凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中，酒精浓度过低时，杀菌能力减弱。

11.用紫外线进行消毒时，可以怎么做来加强消毒效果？照射前,适当喷洒酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。

12.灼烧灭菌是将需灭菌的用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，优点是可以迅速彻底地灭菌。

13.培养基的灭菌方法高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）；培养皿的灭菌方法干热灭菌（也可用湿热灭菌法）。

14.下图表示对接种环的灼烧灭菌,其正确的操作顺序应是②①③。（P11“教材图”）

!//

①②③

三、微生物的纯培养

1.纯培养概念：在微生物学中，将接种于培养基内,在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培

养物。

2.纯培养物概念：由单一个体繁殖所获得的截生物群体称为纯培养物,获得纯培养物的过程就罡纯培养。单

菌卷一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。

3.微生物纯培养的步骤：微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。

5.微生物纯培养的原理：采用平板划线法和稀释涂布平板法将单个微生物分散。

6.在固体培养基上，之后得到的单菌落一般是由单个微生物形成的整养物。

四、酵母菌的纯培养（以酵母菌的纯培养为例）

1糜母菌的纯培养:用马铃薯琼脂培养基培养酵母菌。

菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞

群体。一个单菌落即一个种群。1蓬通常可以用来作为鉴定菌种的重要依据。获得单菌落的方法：平板划

线法和稀释涂布平板法。

2.酵母菌的纯培养:制备培养基、接种和分离酵母菌、培养醉母菌。

（1）制备培养基：制备马铃薯琼脂培养基的正确顺序为：配制培养基-灭菌—倒平板（用文字、"t”表示）。

（2）接种和分离酵母菌：通过接种起在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养

基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。

（3）培养酵母菌：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板（一般做三组，目的：平行重复

实验）和一个未接种的平板倒置,放入登℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养

箱中培养24・48h。

制备培养基的步骤：

①配制培养基:称取去皮的马铃薯200g,切成小块，加水1000mL加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向

滤液中加入20g葡踵糖（也可用蔗糖代替）、15-20g琼脂，用蒸瑞水定容至10（X）ml。

②灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至壁爰瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸,并用皮筋勒紧,再放入高压蒸

气灭菌锅,在压力为lOOkPa,温度为121℃,灭菌15〜30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内,

在160〜170c下灭菌2h。在灭菌前，用牛皮纸、旧报纸包紧盛有培养基的锥形瓶的目的是灭菌时能避免水

蒸汽凝结时浸湿棉塞；取出培养基锥形瓶时也能起到隔绝空气中杂菌污染的作用。

③倒平板:使培养基冷却到亚£左右，在酒精灯火焰附近倒平板。

3.制备培养基实验注意事项

（1）培养基灭菌后为什么要冷却到50℃左右时开始倒平板？琼脂是一种多糖，在44c以下凝固，倒平板

时，温度过高，太烫，不易操作；若低于50C不及时操作，琼脂会凝固。

（2）为什么倒平板和接种整个过程要在酒精灯火焰旁进行？因为酒精灯火焰附近存在着无菌区域，避免避免

周围环境中微生物的污染。拔掉瓶塞后为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微

生物污染培养基。

（3）在倒平板的过程中，若不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间部位，这个平板还能用来培养微生物吗？

不能。为什么?因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。

（4）倒平板时，能将培养皿的皿盖拿下来放在一边吗？丕能。应如何做？用拇指和食指将培养皿打开一条

稍大于瓶口的缝隙。为什么？防止杂菌污染培养基。

（5）刚倒完平板，可以直接倒置吗？不能，应等培养基冷却凝固。

（6）培养基冷凝后，为什么要将培养皿倒过来放置（倒置）？既可防止皿盖上冷凝的水滴滴人培养基造成

污染;又可避免培养基表面的水分过快蒸发。

（4）接种和分离酵母菌验注意事项

①微生物接种中的平板划线法接种是指通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种

逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单个菌落。

②连续划线的目的：将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。

③平板划线法过程中，接种环蘸了]_次菌液；若分五个区划线，则接种环共需灼烧9次；灼烧次数=划线

次数+1。

⑤灼烧后的接种环可以直接划线吗？不可以。应如何操作？待接种环冷却后再划线。目的？避免温度过高

杀死菌种。

⑥从第二次划线开始，都应从上一次划线的末端开始往下一区域划线。

⑦整个操作中灼烧接种环的不同目的：

第一次灼烧（取菌种前）：杀死接种环上原有微生物，避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。

以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌和，使下一次划线时接种环上的菌种直接来

源于上一次划线的末端。

划线结束灼烧：及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。

⑧除第一次划线外，每次划线都从上一次划线的末端开始，目的是什么？将聚集的菌种逐步稀释分散到培

养基的表面，经数次划线后培养，可以分离得到单菌落（使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，

最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落）。

⑨为什么划线时要注意不能划破培养基？

a一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的;

b.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。

⑩用平板划线法接种划线某个平板培养后，第一区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的

第一条线上无菌落，其他环线有的落。造成划线无菌落的原因：a.接种环未冷却。b.划线未从第一区域末端

开始划线（第二区域的第一条线未接到第一区域末端）。

7.如何确定所倒平板未被杂菌（主要是细菌）污染？将未接种的空白培养基放入37℃的恒温箱中培养12h〜

24h,观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底（该操作也可确定培养基灭菌是否彻底）。

8.未接种的培养基直接培养起什么作用？做空白对照，判断培养基是否被污染，判断培养基灭菌是否彻底;

若培养后培养基表面无菌落，则说明培养基没有污染。

9.若未接种的培养基表面出现菌落，说明了什么？说明培养基被污染，实验组的菌落中可能存在杂菌。

10.注意:

（1）在实验室中，切不可饮食，离开实验室时一定要洗手,以防止被微生物感染;

（2）使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。

11.下图①〜⑥为平板划线法接种图示，①操作是将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。②

操作是在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。③操作是将试管口通过火焰。④操作是在火

焰附近用接种环蘸取一环菌液。⑤操作是将试管口通过火焰,并塞上棉塞。⑥操作是：在火焰附近将皿盖

打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线,盖上皿盖。然后再灼烧接种环,待其冷却

后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线即可得到图

⑦培养皿。在重复划线时，注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

①②③④⑤⑥⑦

二、微生物的选择培养和计数

（-）选择培养基

1.实验室筛选原理：人为提供有利于目的菌牛.长的条件（包括营养、温度和pH等）,同时抑制或阻止其他微

生物的生长。

2.实例：水生栖热菌能在吐典工的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。据此，科

学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酷。这种陋

目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合濯链式反应（PCR）。

3.选择培养基定义：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的

培养基，称为选择培养基。

4.寻找耐高温DNA聚合酶的思路是什么？根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

5.从环境中获得某种特定种类的微生物的原理：某些微生物适应某些特定的环境条件，而绝大多数微生物在

这种条件下不能生存，就可以从特定的环境中筛选得到特定种类的微生物。

（1）在被石油污染的土壤中可以筛选在蚊堇微生物。

（2）在冰川冻土层可以筛选耐寒微生物。

（3）漆酶属于木质降解酶类，分离产漆酶菌株的首选样品是生活污水吗？不是。

6.选择培养基三种筛选方法：

（1）利用营养缺陷进行选择培养。某种营养缺陷的微生物不能正常生长

（2）利用添加某种化学物质进行选择培养。*添加杀伤性物质,有抗性的可以生长，无抗性的死亡

（3）利用改变培养条件进行选择培养。*调节温度、pH等生长条件，只有适应的可以生长

8.选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或对其某一化学、物理因素的抗性不同而制备选

择培养基。

（二）微生物的选择培养（以培养土壤中分解尿素的细菌为例）

1.稀释涂布平板法（活菌计数法），稀释涂布平板法基础操作包括:梯度稀释和涂布平板。

2.稀释涂布平板法方法概述：由「土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进

行充分稀释,然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。

3.平板划线法的作用：分离纯化微生物。稀释涂布平板法的作用：分离纯化微生物、统计样品中活菌的数目。

4.分离纯化微生物具体含义：将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到单菌落（即纯培养物）。

5.稀糕涂布平板法分离分解尿素的细菌操作过程如下：

（1）系列稀释操作：如下图所示，在编号为lxl（）2〜]xi（）7试管中分别盛有9mL无菌水；将10g土样加入

盛行90mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀;取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中,依次等比稀释。

稀择液稀释液稀样液稀择液稀释液稀释液

（2）涂布平板操作：第1步：取药液——取0.1mL菌液，滴加到培养基表面;第2步：涂布器消毒——将

涂布器浸在盛有酒精的烧杯中:第3步：涂布器灭菌——将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器

冷却后,再进行涂布；第4步：涂布平板：用涂布器将菌灌均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养

皿，使涂布均匀。

第1步第2步第3步第4步

（3）培养：待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入恒温培养箱中培养1〜2d,在涂布有合适浓

度菌液的平板上就可以观察到分离的里龌。

6.注意：

①在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多（0.1ml）的原因是培养基表面的菌菌悬液会出现

积液，导致菌体堆积，影响分离效果。

梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落;目的：将聚集的菌体分散开，以便

获得单菌落。

②梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。

③涂布器浸在酒精中的主要目的是为涂布器的灼烧灭菌做准备;为保证菌液均匀分布，应在涂布时转动培

养皿。

④将涂布器从酒精中取出时，要亡多余的酒精在烧杯中涯尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布

器放到盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。

⑤a.以上操作均在酒精灯火焰旁进行,防止杂菌污染。

b.若要分离并统计活菌数，应选用稀释涂布平板法。

c.平板划线法不能用于活菌计数的原因是菌落连成片，无法计数。

7.③号试管稀释倍数为血。

1n

168个菌落

175个菌落

167个菌落

10g90mL①

土样无菌水9mL无菌水

（三）微生物的数量测定

微生物的数量测定方法：间接计数法一稀释涂布平板法

直接计数法——显微镜直接计数法、流膜法。

1.稀释涂布平板法

（1）原理：当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个单菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少适菌。

（2）计数原则：一般选择菌落数为a匕皿的平板进行计数。样品的敏度将直接影响平板上的菌落数目，

通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少为支个平板进行重复计数，然后求出

平均值。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数FI。

（3）注意事项：用稀释涂布平板法统计活菌数目时，统计的菌落数往往比适置的实际数目少，这是因为当

两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是二±菌落。因此，统计结果一般用整数而不是用活菌

数来表示。

2.显微镜直接计数法：该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数，然后再计算

一定体积的样品中微生物的数最，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。

3.稀释涂布平板法结果分析：

（1）统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只

是一个菌落。

（2）统计结果一般用整数而不是用活菌数来表示。

4.C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值（mL）；M代表

稀释倍数；则每匕样品中的细菌数=（C+V）xM。

5.将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3人平板上的菌

落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为（39+38+37）+3中.1x100x1000。

6.恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。

7.显微镜直接计数法原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算二

定磔的样品中微生物的数量。

8.显微更接计数法优点：快速直观。

9.显微直接计数法缺点：

（1）统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。原因：不能区分死菌与活菌。

（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。

（四）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1.实验原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成典酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素

作为唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。

2.实验步骤：

土壤取样一制备培养基一样品的稀释与涂布平板一微生物的培养与观察。

（1）土壤取样：

①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤,原因：细菌适宜在该环境中生长.

②取样过程：取样时一般要铲去表层土。原因：细菌绝大部分分布在距地表3・8cm的土壤层。

③注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。

（2）制备培养基：

①作对照：牛肉膏蛋白陈培养基。作用：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。

②实验组：选择培养基。特点：以尿素为唯一氮源。

培养基中KH2P04和NazHPCU的作用：提供无机盐、调节pH。尿素作用：氮遮.葡萄糖作用：碳源,

（3）样品的稀释弓涂布平板：

①1g土的体积约为,l（）g土加入到90ml无菌

水，相当于稀释了坨倍。

假如IO"稀释度下涂布的3个平板的菌落数分别为

42、40和38,则1ml稀释液中的菌株数为400,

IO,稀释度的试管中的菌株数为4xlQ\IO?稀释度的

试管中的菌株数为生M，IO1稀释度的锥形瓶中的菌

株数为4x107。I。1稀释度的锥形瓶中的菌株来自于

10g±,所以1g土中的菌株数为空1登。

②每个浓度至少设置生个平板。1.2.3平板是实验组,为选择培养基,做3组的目的平行重复。4是对照组,

为牛肉膏蛋白陈培养基。

③整个实验还需要设置2个平板，是哪两个？不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白陈培养基.目的:

用来判断培养基中是否含有杂菌（培养基灭菌是否合格）。

④为获得菌落数在亚幽之间适于计数的平板，测细菌时，一为选用1（落1（户、1（）6倍稀释的稀释液进行平

板培养。

⑤在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样才能保证能从中选择出菌落数在30〜300的平板进行计

数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养（例如可以将1X103.1X107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培

楚。

⑥本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记,例如，在标记培养皿时应该注

明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。

⑦标记时注意标记在皿底，不能标记在皿盖。

（3）微生物的培养与观察

（1）培养条件：细菌一般在30・37℃的温度下培养1C的

（2）观察：每隔绝统计一次菌落数目，选取菌落数目稹定时的记录作为结果。

（3）为什么选取菌落数目稳定时的记录作为结果？防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

（4）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征,如形状、大小和颜色等。

（4）结果分析

①说出下列各组培养基的目的：

3组接种的选择培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计。

1组接种的牛肉育蛋白腺培养基：判断选择培养基是否具有选择作用。

不接种的选择培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。

不接种的牛肉膏蛋白腺培养基：验证牛肉牛蛋白陈培养基中是否含有杂菌。

②说出以下现象对应的结果分析：

现象分析

未涂布培养基上无菌落生长培养基未被杂菌污染

未涂布培养基上有菌落生长培养基被杂菌污染

牛肉膏蛋白陈培养基上的菌落数目明显多于选择选择培养基具有选择作用

培养基上的菌落数目

③样品稀释操作成功的标志是什么？得到2个或2个以上菌落教在30-300的平板。

④得到的菌落一定是分解尿素的细菌吗？不一定，还需要进一步的鉴定。

注意:

1.如何设计培养基筛选分解尿素的细菌？以尿素作为唯一氮源设计选择培养基，只有能合成服酶的细菌才能

生长发育繁殖。

2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普

通培养基基本相同。

3.在选择培养基上生长的一定是所选择的目的菌吗？不一定，有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生

长繁殖，所以还需要进一步验证。

4.怎么证明一个选择培养基具有选择性？应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白性培养基）或完全培养基作为

对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选拦培养基，则该选择培养基具有选择性。

5.尿素可为尿素分解菌提供氮源的原因？尿素可为尿素分解菌提供碳源吗？为什么？尿素分解菌能合成原

酶，服酶能催化分解尿素产生NH3和CO2,NH可作为尿素分解菌的氮源。但不能作为碳源，因为尿素分

解菌不是自养生物，不能利用CO2作为氮源。

（五）进一步探究——分解尿素细菌的进一步鉴定（自选）

1.原理:分解尿素细菌合成的服酶将尿素分解为CO2和NH3,NH3溶于水会电离出NE+和OH-,使培养基的

碱性增强,pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应,进而判断该菌是

否为尿素分解细菌：

2.方法：

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。

液体培养基可以直接看液体的变色情况；

固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带;

红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。

第3节发酵工程及其应用

一、发酵工程的基本环节

I.发酵工程的基本环节：下图为发酵工程的基本环节图，图中①〜⑤处所填写的内容依次是：①选育菌种;

②灭菌;③接种;④发酵;⑤分离、提纯产物。

配制培养基

®I

扩大♦

培养一►③—►④—*⑤一►获得产品

（I）选育菌种

①选育菌种目的：获得性状优良的菌种。

②选育方法（菌种来源）：可以从自然界中筛选出来,也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。

③）菌种选育的重要性（意义）：优良的菌种不仅具有健世，不易退化,其发酵产品的产量高、质量稳定等优

点，它往往还会赋予发酵产品独特的风味,因此菌种选育环节在很大程度上决定了生物发酵产物的成败。

（2）扩大培养：

①目的：获得更多的苗种。

②原因：工业发酵工的体积一般较大,因此，需要接入的菌种总体积大（数目多）。

③扩大培养的培养基：一般为液体培养基。

（3）配制培养基的要求：

①在菌种确定之后,（结合菌种代谢特点）选择原料制备培养基。

②在生产实践中，培养基的配方要经过反复试验才能确定。（即不断优化培养基）

（4）灭菌

①目的：避免因杂菌污染而影响产品的品质和产量。

②培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌原因：发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污

染，可能导致产量大大下降。

（4）接种：扩大培养的菌种和灭菌后的培养基加入发酵罐中。大型发酵罐有计算机控制系统，能对发酵过

程中的温度、过1、溶解氧、罐压、通气量、搅拌、泡沫和萱养等进行监测和控制。

（5）发酵罐内发酵

下图为发酵罐示意图，图中①〜⑤处所填写内容依次为：①排气管:②排为口:③温度:④进入口;⑤空

气。

①发酵罐内发酵是发酵工程的中心环节。

②发酵罐内发酵严格控制发酵条件的原因：

a.环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖，而且影响微生物代谢物的形成;

b严格控制发酵条件，有利于使发酵全过程处于最佳状态。

③发酵罐内发酵要求：在发酵过程中，要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等,以r解发酵进程。

还要及时添加必需的营养组分,要严格控制温度、DH和溶解氧等发酵条件。

④不同发酵条件的影响实例——谷氨酸发酵

a.在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸。

b.在酸性条件下则容易生成谷氨酰胺和N・乙酰谷胺酰胺。

⑤现代发酵工程使用的发酵罐的优点：均有计算机控制系统,能对发酵过程中的温度、pH、溶氧量、罐压、

通气量、搅拌、泡沫和营养等进行监测和控制,还可以进行反馈控制,使发酵全过程处于最佳状态。

（6）产品的分离、提纯

①产品的分离、提纯目的：获得产品。

②产品的两种形式：微生物细胞本身、代谢物。

③分离、提纯产物采取手段：如果发酵产品是微生物细胞本身,可在发酵结束之后,采用过速、沉淀等方

法将菌体分离和干燥得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提里、分离和纯化措施

来获得产品。

2.微生物菌种资源丰富，选择发酵工程用菌时.，需要考虑哪些因素？

（1）在低成本的培养基上能迅速生长繁殖。（2）生产所需代谢物的产量高。

（3）发酵条件易控制。（4）菌种不易变异，退化等。

3.怎样对发酵条件进行调控以满足微生物的生长需要？

（1）反复试验确定培养基的配方；（2）对培养基和发酵设备进行严格的灭菌；

（3）随时枪测培养液中微生物的数量、产物浓度等;（4）及时添加必需的营养组分:

（5）严格控制温度、pH和溶氧量等发酵条件，使用计算机控制系统对各种条件进行监测和控制，以及反

馈控制.

4与传统的手工发酵相比，在啤酒的发酵生产过程中，能明显提高啤酒的产量和质量的工程手段有：菌种的

选育、对原材料的处理、发酵过程的控制、产品的消毒等。

5.在进行发酵生产时，排出的气体和废弃培养液等能直接排放到外界环境中吗?为什么？

不能；因为在进行发酵生产时，微生物及其代谢物中都可能含有危害环境的物质。为了减少或避免污染物

的产生和排放，实现清洁生产，应该对排出的气体和废气培养液进行二次清洁或灭菌处理。

6.注意：

（1）谷氨酸发酵常用菌种为谷氨酸棒状杆菌;

（2）谷斑酸棒状杆菌的代谢类型为异养需氧型,其与有氧呼吸有关的酶主要存在于细胞膜上；

（3）C:N的数值也会影响谷氨酸发酵过程：

C:N=4:I时，菌体大量繁殖，谷氨酸产生量较少；

C:N=3:1时，菌体繁殖受抑制，谷氨酸产生量较笺.

二、发酵工程的应用

1.发酵工程以其生产条件温和、原料来源丰富且价格低廉、产物专一、废弃物对环境的污染小和容易处理等

特点，在食品工业、医药工业、农牧业等等许多领域得到广泛应用。

2.食品工业是微生物最早开发和应用的领域。一直以来，与发酵有关的食品工业的产量和产值都居于发酵工

业的首位。

3.发酵工程与传统发酵技术相比，在产物分离和提纯方面有较大改进。主要体现在：传统发酵技术获得的产

物一般不是单一的组分，而是成分复杂的混合物,很多时候不会（会、不会）再对产物进行分离和提纯处

理，或者仅采用简单的汉篷及海等方法来分离和提纯产物。在发酵工程中使用的分离和提纯产物的方法

较多。在产物的初分离阶段，常采用沉淀、萃取、膜分离、吸附和离子交换等方法;在进一步纯化阶段，

会采用液相层析法、结晶法等方法。发酵工程产物无论是代谢物还是菌体本身，都需要进行质量检查，合格

后才能成为正式产品。

4.发酵工程在食品工业的应用包括：主要有：生产传统的发酵产招、生产