生物素亲和素标记技术

生物素、亲和素标识技术广州医学院第一从属医院检验科廖伟娇1/21一、生物素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特征等电点其它特征

2/211概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布一个小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。分子式：C10H16O3N2S分子量：244.313/21结构特点：咪唑酮环/四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质溶解特征：难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)4/21等电点：PH=3.5其它特征：羧基需经活化修饰才能结合蛋白质（羧基活化生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）5/21生物素衍生物种类及特征：1生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)：DMF制备：生物素+N-羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺标识特点：BNHS中羧基与蛋白质中赖氨酸氨基结合到达标识目标适合用于：标识Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA6/21长臂活化生物素(BCNHS)：DMF+6-氨基己酸制备：生物素+N-羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺

(在BNHSB与羧基之间插入2分子6-氨基己酸）标识特点:(同BNHS)BCNHS中羧基与蛋白质中赖氨酸氨基结合到达标识目标适用：(同BNHS)标识Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA7/213生物素酰肼(BHZ)：制备：生物素+水合肼标识特点：BHZ与蛋白质中醛基结合而标识适用：标识偏酸性蛋白质、酶、DNA8/21三、亲和素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特征等电点其它特征9/211概念：亲和素(avidin)：是动物微生物中提取一个含10%碳水化合物碱性糖蛋白。链霉亲和素：是从链球菌属菌培养液中提取一个蛋白质分子量：A:6.7KDSA:6~6.5KD10/213结构特点：每分子由四个亚基组成溶解特征：溶于水，C=5mg/ml等电点：A:PH=10.5SA:PH=6.0比活性：A≥12u/mgPSA≥14u/mgP11/21四、亲和素活性及其测定1亲和素活性：是表示亲和素结合生物素能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。12/21活性测定：⑴羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法：A(SA)+HABA（红色）BA-B（出现黄色时B量）

⑵分光光度法：13/21五、生物素标识物及亲和素标识物制备：1生物素标识物制备：

B+Ab/Ag/E交联剂B-Ab/Ag/E亲和素标识物制备：A/SA+Ab/Ag/E交联剂A/SA-Ab/Ag/E14/21六、技术类型：可有Ag与Ab反应各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在次基础上引入A-B系统。BAB法：Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-A

B·EAg-Ab·B-A-B·E特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E

返回15/21BA法：Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A-B·E特点：以A-E/SA-E代替BAB法中A，省却了加B-E步骤16/21ABC法：⑴A+B·EA-B·E----------ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点：将BAB法中A先与B-E结合，制备成复合物ABC17/21返回+A+A18/21Ag-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E返回19/21++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-B+ABC