第50讲　微生物的培养技术及应用

第50讲微生物的培养技术及应用(1)阐明在发酵工程中防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的前提。(2)阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。(3)举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。(4)概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。(5)概述稀释涂布平板法和显微镜直接计数法是测定微生物数量的常用方法。课标内容1目

录微生物的基本培养技术23微生物的选择培养和计数关键·真题必刷基础·精细梳理典例·精心深研考点一微生物的基本培养技术1.培养基的配制 (1)培养基的概念、

类型和用途营养物质生长繁殖液体

积累其代谢物(2)培养基的配方①主要营养物质：水、______、氮源、________。②其他条件：pH、______________和氧气。如下表：碳源无机盐特殊营养物质微生物乳酸菌霉菌细菌厌氧微生物特殊需求添加_______pH调至______pH调至____________________维生素酸性中性或弱碱性无氧2.无菌技术(1)目的获得______________。(2)关键______________。(3)常用方法______和______。纯净的培养物防止杂菌污染消毒灭菌(4)无菌技术的主要方法及适用对象(连一连)3.微生物的纯培养 (1)概念辨析固体培养基一定形态结构(2)酵母菌纯培养的操作步骤15～20g琼脂湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法干热灭菌

酒精灯火焰灼烧灭菌(2)酵母菌纯培养的操作步骤平板划线法恒温培养箱28下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析并回答下列问题：(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？__________________________________________________________________________________________。

获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析并回答下列问题：(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？____________________________。

最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌火焰附近存在着无菌区域1.倒平板的操作步骤①培养基要冷却到50℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。②要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。③倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。④平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

2.平板划线法操作步骤2.平板划线法操作步骤(1)实验成功关键点(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的考向1

结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维1.(2024·广东深圳联考)某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的固体培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将5个手指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。下列相关叙述错误的是(

)A.这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有培养皿和培养基等B.“将手指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的接种C.从实验结果来看，洗手后的操作不会污染培养基D.培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的

解析

从实验结果看，贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少，并不能说明洗手后的操作不会污染培养基，C错误。CD2.(2024·西安高新一中模拟)在实验室培养微生物，需要人为地为微生物提供适宜的营养和环境条件。下列关于培养基配制的说法正确的是(

)A.培养基中需要碳源、氮源、水和无机盐齐全B.培养基中必须添加琼脂C.培养基制备中均需调节pH至酸性D.无论哪种培养基均需要灭菌解析培养固氮微生物时，培养基中可以不添加氮源，A错误；只有配制固体(或半固体)培养基时才需要添加琼脂，B错误；适宜的pH是微生物生长的必需条件，因此配制过程中需要调节pH，培养霉菌时一般需要将pH调至酸性，培养细菌时，一般需要将培养基调至中性或弱碱性，C错误；培养基均需要灭菌，D正确。D考向2结合微生物的纯培养，考查科学探究能力3.(2024·东北育才中学模拟)下列关于“酵母菌的纯培养”实验的叙述，错误的是(

)A.马铃薯捣烂后的滤液中含有酵母菌生长所需的多种营养成分B.接种环灭菌时，顶端的环和环后的部分柄均需通过火焰灼烧C.平板划线时，接种环应在固体培养基表面轻轻地连续划线D.完成平板划线后，应将平板立刻倒置培养以免污染培养基解析马铃薯捣烂后的滤液中含有酵母菌生长所需的多种营养成分，如碳源、氮源和无机盐等，A正确；接种环灭菌时，顶端的环和环后的部分柄均需通过火焰灼烧，防止杂菌的污染，B正确；平板划线时，接种环应在固体培养基表面轻轻地连续划线，防止划破培养基表面，影响实验结果的观察，C正确；完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，再将平板倒置培养，D错误。B4.(2024·广州联考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种分解尿素的细菌，培养结果如图所示。下列叙述错误的是(

)A.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌B.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整C.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落D.该实验结果出现了单菌落，能达到菌种纯化的目的解析

倒平板后无需晃动，B错误。基础·精细梳理典例·精心深研考点二微生物的选择培养和计数1.选择培养基抑制或阻止尿素高温常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。

2.稀释涂布平板法(1)系列稀释操作取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。(2)涂布平板操作

酒精培养基表面3.微生物的数量测定(1)利用稀释涂布平板法计数①为了保证结果准确，一般选择菌落数为______________的平板进行计数，并且在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，并求平均值。②统计结果往往比实际值____。(2)利用显微镜直接计数①需用特定的细菌计数板或血细胞计数板。②统计结果一般是________________的总和。30～3003少活菌数和死菌数4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 (1)实验原理脲酶尿素(2)操作步骤30～300温度时间24h菌落(3)实验结果分析与评价30～3005.分解纤维素的微生物的分离 (1)分离方法与原理(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理纤维素刚果红红色复合物(1)血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定。(2023·江苏卷，7D)(

)提示血细胞计数板不适用于微小的细菌计数。(2)某同学欲分离产脲酶菌，可在选择培养基中添加尿素作为唯一氮源。(2022·江苏卷，3B)(

)(3)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细菌计数。(2021·浙江6月选考，17C)(

)提示平板划线法只能用于细菌分离，不能用于细菌计数。×√×(4)利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物，而保留利用尿素的微生物。(2020·浙江7月选考，19A)(

)提示尿素固体培养基属于选择培养基，以尿素为唯一氮源，不能利用尿素的微生物因缺乏可利用的氮源而不能在此培养基上生存，故尿素固体培养基的作用并不是迅速杀死这些微生物。×1.为什么只有能分解尿素的微生物才能在尿素固体培养基上生长？___________________________________________________________________ _________________________________________________________________。2.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌的原因是_____________________ ___________________________________________________________________________________________________________________。分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源

生物与环境具有相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，从这种土样中获得目的微生物的概率要高于普通环境3.在含有纤维素的培养基中加入刚果红对纤维素分解菌进行选择形成透明圈的原因是_____________________________________________________________ _________________________________________________________________。

刚果红与纤维素形成红色复合物，而当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈考向1

结合微生物的选择培养，考查科学思维1.(2024·广东佛山模拟)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述错误的是(

)AA.图中①②④为基本培养基，③为完全培养基B.A操作的目的是提高突变频率，增加突变株的数量C.B的正确操作是用涂布器把菌液均匀地涂布在②表面D.经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D进行纯化培养解析野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题图可知，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A错误；紫外线可以提高突变的频率，从而增加突变株的数量，B正确；B的正确操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀地涂布在②表面，C正确；从图中可知，D在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明D是氨基酸营养缺陷型突变株菌落，故经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D菌落进行纯化培养，D正确。A2.(2024·江西新余调研)耐高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。嗜热菌可以在高温环境中生存，其产生的淀粉酶最适温度较高。筛选能产生耐高温淀粉酶的嗜热菌过程如图1所示，其中Ⅰ号培养基用碘液处理的结果如图2所示。下列叙述正确的是(

)图1

图2A.图2中周围不显蓝色的菌落含有所需菌种B.倒平板后对培养皿进行高压蒸汽灭菌C.淀粉是图2所示固体培养基的唯一碳源D.甲、乙试管中均为选择培养基图1

图2解析淀粉与碘液反应呈现蓝色，能分解淀粉的嗜热菌在培养基上生长时可释放淀粉酶，分解培养基中的淀粉，故周围不显蓝色的菌落含有所需菌种，A正确；倒平板前培养皿和培养基都已灭菌处理，因此倒平板后不需要对培养皿再进行高压蒸汽灭菌，B错误；据图2可知，培养基上出现周围显蓝色的菌落和周围不显蓝色的菌落，因此淀粉可能不是图2所示固体培养基的唯一碳源，C错误；图1中①过程是梯度稀释，②过程是用稀释涂布平板法进行接种，因此甲、乙试管主要是对嗜热菌样品进行稀释，不具备选择作用，不属于选择培养基，D错误。A考向2结合微生物的分离与计数，考查科学思维3.(2024·河北石家庄调研)北京冬奥会食堂让各国运动健儿爱上中国味道，其餐余垃圾在垃圾集中点采用生化＋雾化＋膜过滤技术处理后，可以达到无二次污染的标准。为筛选对抗生素有抗性、高效降解淀粉的微生物，提高“生化”处理的效率，研究人员将餐余垃圾机械化处理后加入装有无菌水的锥形瓶中制备餐余垃圾浸出液，然后进行如图所示操作，下列说法错误的是(

)A.餐余垃圾浸出液在接种前通常需要进行高压蒸汽灭菌处理B.可用稀释涂布平板法将餐余垃圾浸出液接种在X培养基上C.X培养基含有淀粉和抗生素，Y培养基是不含琼脂的液体培养基D.图中高效降解淀粉的微生物是⑤，可根据菌落特征初步判断微生物类型解析若对餐余垃圾浸出液进行高压蒸汽灭菌会杀死菌种，导致实验失败，A错误；微生物的接种方法包括稀释涂布平板法和平板划线法，可用稀释涂布平板法将餐余垃圾浸出液接种在X培养基上，B正确；结合题意可知，本实验的目的是筛选对抗生素有抗性、高效降解淀粉的微生物，故图中X培养基以淀粉为唯一碳源，且应添加抗生素起选择作用；Y培养基是液体培养基，进行扩大培养，其中不含凝固剂琼脂，C正确；淀粉遇碘变蓝色，加入碘液后，能够分解淀粉的菌落周围出现透明圈，图中能高效降解淀粉的微生物是⑤(透明圈最大)，不同微生物形成的菌落特征不同，可根据菌落特征初步判断微生物类型，D正确。4.(2024·广东湛江模拟)自生固氮菌是土壤中能独立进行固氮的细菌。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图。已知步骤④获得的3个平板的菌落数分别为90、95、100，对照组平板为0。下列相关叙述正确的是(

)CA.步骤②振荡20min的目的是扩大菌种数量，属于选择培养B.步骤④→⑤使用接种环划线接种，使用前需要灼烧灭菌C.1g土壤中平均自生固氮菌数约为9.5×106个D.所用培养基应加入碳源、氮源、无机盐、水和琼脂解析步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中，A错误；由题图可知，步骤⑤平板中的菌落分布均匀，故步骤④→⑤所用的接种工具是涂布器，接种方法是稀释涂布平板法，B错误；1g土壤中平均自生固氮菌数约为(90＋95＋100)/3÷0.1×104＝9.5×106(个)，C正确；本实验需要分离的自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，故所用培养基中不能加入氮源，D错误。两种纯化细菌的方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法纯化原理通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落两种纯化细菌的方法的比较项目平板划线法稀释涂布平板法主要步骤平板划线操作系列稀释操作和涂布平板操作接种工具接种环涂布器平板示意图关键·真题必刷1.(2023·江苏卷，7)下列关于细菌和酵母菌实验的叙述正确的是(

)A.通常酵母菌培养基比细菌培养基有更高的碳氮比B.通常细菌的生长速度比酵母菌快，菌落比酵母菌菌落大C.通常细菌培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，酵母菌培养基用过滤除菌法除菌D.血细胞计数板既可用于酵母菌的数量测定，也可用于细菌的数量测定A解析微生物种类不同，所需营养物的碳氮比也不同，具有高碳氮比的生物需要高碳氮比的营养物，反之则低；酵母菌的碳氮比高于细菌，所以培养酵母菌的培养基需要更高的碳氮比，A正确；通常细菌的生长速度比酵母菌快，但形成的菌落不一定大于酵母菌菌落，这与细菌种类有关，B错误；微生物培养基通常都采用高压蒸汽灭菌法灭菌，C错误；血细胞计数板适用于酵母菌的计数，不适用于微小的细菌计数，D错误。C2.(2023·湖南卷，5)食品保存有干制、腌制、低温保存和高温处理等多种方法。下列叙述错误的是(

)A.干制降低食品的含水量，使微生物不易生长和繁殖，食品保存时间延长B.腌制通过添加食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖C.低温保存可抑制微生物的生命活动，温度越低对食品保存越有利D.高温处理可杀死食品中绝大部分微生物，并可破坏食品中的酶类解析干制能降低食品中的含水量，使微生物不易生长和繁殖，进而延长食品保存时间，A正确；腌制通过添加食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖，B正确；低温保存可以抑制微生物的生命活动，但不是温度越低越好，一般食品保存温度为零上低温，C错误；高温处理可杀死食品中绝大部分微生物，并通过破坏食品中的酶类，降低酶类对食品有机物的分解，有利于食品保存，D正确。3.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(

)A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌D解析动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。4.(2023·广东卷，10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(

)DA.A点时取样、尿素氮源培养基B.B点时取样、角蛋白氮源培养基C.B点时取样、蛋白胨氮源培养基D.C点时取样、角蛋白氮源培养基解析

研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌具有既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白的功能，所以在C点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D正确。5.(2022·江苏卷，3)下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(

)A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株D解析农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配制的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。6.(2023·山东卷，15)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(

)A.不含氮源的平板不能用于微生物培养B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物D解析不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须灭菌，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。7.(2023·全国乙卷，37改编)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时