凝血因子Ⅷ抑制物测定试验标准操作程序-202

凝血因子Ⅷ抑制物测定试验标准操作程序-2021.适用范围本文件为凝血检验专业组编号SOP-202的标准化操作文件，适用于符合生物安全二级（BSL-2）标准的医疗机构临床实验室开展人血浆凝血因子Ⅷ（FⅧ）抑制物定量检测，检测结果用于血友病A患者替代治疗后的同种抗体监测、获得性血友病A的辅助诊断及出血性疾病的鉴别诊断。实验室所有从事该项检测的技术人员必须经过培训并考核合格，严格按照本程序操作，不得随意更改操作流程。2.检测方法选择与方法学溯源本程序采用国际血栓与止血学会（ISTH）、世界卫生组织（WHO）推荐的Nijmegen改良Bethesda法为标准检测方法，检测系统溯源至WHOFⅧ抑制物国际标准品（NIBSC编码07/316）。相较于经典Bethesda法，Nijmegen改良法通过采用乏FⅧ血浆作为受检标本稀释液、控制反应体系pH稳定在7.4±0.05、保证反应体系蛋白浓度一致，可将低滴度抑制物（<1BU/mL）检测的假阳性率从经典方法的15%~20%降至3%以下，检测重复性、准确性显著提升，是目前临床FⅧ抑制物检测的参考方法。3.检测原理FⅧ抑制物是一类可时间依赖性、温度依赖性灭活FⅧ促凝活性（FⅧ:C）的免疫球蛋白，90%以上为IgG型（以IgG4亚型为主），既可见于血友病A患者长期输注外源性FⅧ制品后产生的同种抗体，也可见于自身免疫病、妊娠、恶性肿瘤、药物诱导产生的自身抗体（即获得性血友病A）。检测核心原理为：将不同稀释度的受检血浆与FⅧ活性标定为1.0IU/mL的正常混合血浆按1:1比例混合，置于37℃恒温水浴中孵育2小时，使抑制物充分灭活体系中的FⅧ；同时设置平行对照管（等体积乏FⅧ血浆与正常混合血浆同条件孵育）作为FⅧ活性基线；孵育结束后采用一期凝固法测定各管残余FⅧ:C水平。Bethesda单位（BU）定义为：标准反应条件下（37℃孵育2小时，受检血浆与正常混合血浆1:1混合），能使体系中50%FⅧ:C失活的抑制物含量为1BU/mL。4.试剂与材料4.1核心试剂4.1.1正常混合血浆（NPP）：优先采用实验室自制或取得医疗器械注册证的商品化Bethesda法专用正常混合血浆。自制NPP需采集20份以上18~55岁健康供者的3.2%枸橼酸钠抗凝全血，供者排除凝血功能异常、妊娠、1周内服用影响凝血功能药物、肝肾功能异常、感染性疾病标志物（HBV、HCV、HIV、梅毒）阳性；全血采集后室温2500g离心15分钟分离乏血小板血浆（血小板计数<10×10^9/L），充分混匀后分装为0.5mL/支，密封后置于-70℃以下超低温冰箱保存，有效期6个月；使用前37℃快速融化，禁止反复冻融，融化后需标定FⅧ:C水平在0.9~1.1IU/mL之间、pH7.35~7.45，FⅧ活性自然降解率（37℃孵育2小时后活性剩余率）>90%方可使用。不得使用常规凝血校准品替代NPP，避免因缓冲体系、蛋白浓度差异导致结果偏差。4.1.2乏FⅧ血浆：采用有医疗器械注册证的商品化乏FⅧ血浆，要求FⅧ:C活性<0.01IU/mL，其余内源性、外源性凝血因子（FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ、纤维蛋白原）活性>0.5IU/mL，无肝素、狼疮抗凝物、直接口服抗凝药（DOACs）污染，2~8℃避光保存，有效期参照试剂说明书，使用前平衡至室温。乏FⅧ血浆既是受检标本的预稀释液，也是对照管的基质液，其蛋白浓度、pH需与NPP匹配，保证反应体系稳定。4.1.3咪唑缓冲液：精确配制pH7.4±0.05的咪唑缓冲液，配方为：咪唑3.40g、氯化钠5.85g，溶于900mL纯化水，用1mol/L盐酸调节pH至7.4后定容至1000mL，2~8℃保存，有效期1个月，使用前平衡至室温，主要用于FⅧ活性测定时的血浆稀释。4.1.4活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂：选用对FⅧ:C高敏感性的鞣花酸激活剂型APTT试剂，要求FⅧ检测下限≤0.01IU/mL，对肝素（≤0.5IU/mL）、狼疮抗凝物的干扰可通过配套算法校正，试剂批内CV<5%，有医疗器械注册证；冻干试剂按照说明书要求复溶，复溶后2~8℃保存7天，禁止冷冻，使用前充分轻柔混匀，避免产生气泡。4.1.50.025mol/L氯化钙溶液：为APTT试验的启动试剂，可采用商品化配套试剂或自行精确配制，标定钙离子浓度误差<5%，2~8℃保存，有效期3个月。4.1.6FⅧ抑制物质控品：采用溯源至WHO国际标准品的商品化高低两个水平定值质控品，低水平质控靶值范围0.5~1.0BU/mL，高水平质控靶值范围5~20BU/mL；也可采用经标定的检测剩余阳性患者混合血浆（HBV/HCV/HIV标志物阴性），分装后-70℃保存，有效期6个月。质控品不可反复冻融，复溶后2小时内使用。4.1.7抗凝药中和剂：根据临床需求配备肝素酶（用于中和标本中≤1.0IU/mL的普通肝素/低分子肝素）、达比加群特异性中和抗体、Xa因子抑制剂中和剂，用于存在抗凝药干扰标本的前处理。4.2试剂性能验证新批次试剂启用前必须完成性能验证，验证合格后方可用于临床检测，验证内容包括：①准确性：测定WHO国际标准品的系列稀释物，测定值与靶值的相对偏倚<15%；②精密度：高低两个水平质控重复测定10次，批内CV<10%，连续测定5天的批间CV<15%；③线性范围：将高滴度阳性血浆用乏FⅧ血浆做1:2、1:4、1:8、1:16、1:32梯度稀释，测定值与理论值的线性相关系数r≥0.99，各稀释度偏倚<20%；④干扰阈值：验证当标本中血红蛋白≤5g/L、胆红素≤200μmol/L、甘油三酯≤6mmol/L、肝素≤0.5IU/mL时，结果偏倚<15%，超过阈值的标本需标注干扰，重新采集合格标本检测。5.仪器设备与耗材5.1全自动凝血分析仪：具备凝固法检测通道，温控精度37℃±0.2℃，计时精度±0.1s，100μL加样量时加样误差<2%、CV<1%；每年由计量检定部门校准温控系统、加样系统、计时系统，持有有效校准证书；每日开机后执行自检、光路校准、探针清洗程序，确认仪器状态正常方可检测。5.2恒温水浴箱：温控范围37℃±0.2℃，内置经计量校准的精度0.1℃的水银温度计，每日早中晚三次记录温度，温度偏差超过±0.5℃时暂停使用，校准合格后方可恢复使用。5.3离心机：具备转速可调功能，最大离心力≥3000g，转速偏差<5%，每半年校准一次转速，用于标本离心分离乏血小板血浆。5.4存储设备：-70℃超低温冰箱用于保存NPP、质控品、留存标本，温度波动范围≤±5℃，配备温度报警装置，每日记录温度；2~8℃冷藏冰箱用于保存试剂，每日记录温度，温度偏差超过±2℃时及时处置。5.5移液器：配备10μL、100μL、1000μL量程的微量移液器，每季度开展内部校准，每年送计量部门校准，加样误差<1%、CV<1%；配套使用无DNA酶、无热原、无凝血激活物的一次性带滤芯吸头。5.6耗材：采用12mm×75mm一次性聚苯乙烯塑料试管（禁止使用玻璃试管，避免玻璃表面负电荷激活凝血因子导致FⅧ消耗）；3.2%枸橼酸钠一次性真空采血管（抗凝剂与全血比例1:9，有医疗器械注册证，在有效期内使用）；一次性手套、医用外科口罩、帽子、生物安全垃圾袋等个人防护与废物处置耗材。5.7生物安全柜：二级A2型生物安全柜，每年由第三方机构检测气流流速、高效过滤器完整性，合格后方可使用，用于标本开盖、加样等操作，防范生物气溶胶暴露。6.标本采集、运输与处理6.1患者准备采血前需确认患者状态：患者需安静休息30分钟，避免剧烈运动、情绪激动，采血前30分钟禁止吸烟。血友病A患者监测抑制物时，需严格避开FⅧ制品输注后的洗脱期：输注普通半衰期重组/血浆源性FⅧ制品后需间隔72小时以上采血；输注聚乙二醇化、Fc融合长效FⅧ制品后需间隔14~21天（5~7个半衰期）采血，避免循环中残留的外源性FⅧ导致抑制物滴度被低估。服用DOACs的患者需至少停药5个半衰期后采血，无法停药的标本需加入特异性中和剂处理后检测。6.2标本采集采用21G或22G一次性采血针，优先选择肘正中静脉穿刺，禁止在静脉输液侧手臂采血，避免输液稀释或药物干扰；止血带结扎时间≤1分钟，见到回血后立即松开止血带，血液沿采血管管壁缓慢流入，禁止用力抽吸、剧烈震荡标本；严格控制采血量，3.2%枸橼酸钠0.3mL对应采集全血2.7mL，采血量误差控制在±10%以内（2.43~2.97mL），保证抗凝比例准确。6.3标本运输采血后标本置于18~25℃室温条件下2小时内送达实验室，禁止高温（>30℃）、低温（<10℃）运输，避免FⅧ活性冷激活或热降解。6.4标本处理实验室收到标本后立即核对信息、检查标本质量，合格标本置于室温下2500g离心15分钟，分离乏血小板血浆，要求血浆血小板计数<10×10^9/L，避免血小板膜磷脂干扰APTT测定。分离后的血浆若无法在4小时内完成检测，需分装为2支0.5mL冻存管，密封后置于-70℃保存，最长保存时间不超过3个月；检测前37℃快速融化5分钟，轻柔颠倒混匀，禁止反复冻融（冻融次数≥2次的标本不得用于检测）。6.5不合格标本拒收存在以下情况的标本予以拒收，记录拒收原因并通知临床重新采集：①标本标识不清、信息与申请单不符；②采血量超出允许误差范围、抗凝比例错误；③标本存在肉眼可见凝块、严重溶血（血红蛋白>5g/L）、严重脂血（甘油三酯>6mmol/L）、严重黄疸（胆红素>200μmol/L）；④标本采集后室温放置超过4小时未离心；⑤经确认从输液通路采集的稀释标本；⑥使用EDTA、肝素等错误抗凝剂的标本。7.操作步骤7.1实验前准备实验开始前30分钟开启恒温水浴箱，确认温度稳定在37℃±0.2℃；开启全自动凝血分析仪，执行日常维护、探针清洗、光路校准，确认仪器状态正常；将APTT试剂、氯化钙试剂、乏FⅧ血浆、咪唑缓冲液从冰箱取出，平衡至室温；将冻存的NPP、受检血浆、高低值质控血浆取出，37℃水浴快速融化5分钟，轻柔颠倒混匀5次，避免产生气泡，融化后15分钟内启动加样操作。7.2标本预稀释Bethesda法仅在残余FⅧ活性为基线的25%~75%区间内符合一级动力学灭活规律，结果准确可靠，因此需对受检血浆做梯度预稀释，保证至少有一个稀释度的残余活性落在该区间：①首次检测的无既往结果的标本，设置3个预稀释度：原倍（不稀释，D1=1）、1:5稀释（100μL受检血浆+400μL乏FⅧ血浆，D1=5）、1:20稀释（100μL1:5稀释血浆+300μL乏FⅧ血浆，D1=20）；②有既往检测结果的随访患者，根据上次滴度结果调整稀释度，覆盖滴度的上下2个数量级。对于基础FⅧ:C>0.1IU/mL的受检血浆（如轻型血友病、获得性血友病早期患者），需额外设置即刻对照管，校正受检血浆自身含有的FⅧ对结果的干扰。7.3孵育体系构建所有试管加盖密封后再进行孵育，避免水分蒸发导致浓度偏差：①正常对照管：加入200μL乏FⅧ血浆+200μLNPP，轻柔混匀；②受检测定管：每个预稀释度取200μL稀释后血浆+200μLNPP，轻柔混匀；③即刻对照管（基础FⅧ:C>0.1IU/mL时设置）：取对应稀释度的200μL稀释血浆+200μLNPP，混匀后立即置于0~4℃冰浴放置，不参与37℃孵育；④质控管：分别取200μL低、高水平质控血浆+200μLNPP，轻柔混匀。将除即刻对照管外的所有试管同时放入37℃恒温水浴箱，准确计时，孵育2小时，孵育过程中试管不得接触水浴箱壁，保证受热均匀；孵育时间误差控制在±2分钟以内，避免时间偏差导致结果偏高或偏低。7.4反应终止孵育满2小时后，立即将所有试管从水浴箱取出，转移至0~4℃冰浴中放置5分钟，快速降温终止FⅧ灭活反应，冰浴时间不超过15分钟，避免FⅧ低温降解。7.5残余FⅧ:C测定采用一期凝固法在全自动凝血分析仪上测定所有试管的FⅧ:C水平，严格按照FⅧ:C一期法检测程序操作：①采用乏FⅧ血浆将已知活性的校准血浆稀释为100%、50%、25%、12.5%、6.25%的系列浓度，在APTT通道测定各浓度的凝固时间，以凝固时间的对数值为纵坐标、FⅧ活性的对数值为横坐标绘制标准曲线，要求标准曲线相关系数r≥0.98，各校准点偏倚<10%，否则重新绘制标准曲线；②将各试管从冰浴中取出，轻柔混匀，避免气泡或纤维蛋白凝块，按照仪器参数设置加样测定凝固时间，根据标准曲线自动计算各管的FⅧ:C值。8.结果计算与有效性判断8.1基线校正首先计算正常对照管孵育后的FⅧ:C值（记为C0），正常情况下C0应在0.45~0.55IU/mL范围内（即NPP与乏FⅧ血浆1:1混合后理论值为0.5IU/mL，孵育2小时后自然降解率<10%），若C0<0.4IU/mL，提示NPP活性降解或试剂失效，本次实验无效。设置即刻对照管的标本，测定即刻对照管的FⅧ:C值（记为C1），若C1与理论值（受检血浆基础FⅧ:C×稀释比例+NPP的FⅧ:C×0.5）的偏差>15%，提示标本存在凝血激活或降解，需重新检测。8.2残余活性计算未设置即刻对照的标本，残余FⅧ活性（RA）=受检测定管FⅧ:C/C0×100%；设置即刻对照的标本，RA=受检测定管FⅧ:C/C1×100%，RA代表孵育2小时后体系中剩余FⅧ活性占初始活性的百分比。8.3Bethesda单位换算选择RA值在25%~75%区间的稀释度，根据ISTH标准化Bethesda换算表查得该反应体系对应的BU值，换算表核心对应值为：RA97%=0.05BU、RA90%=0.15BU、RA80%=0.32BU、RA75%=0.41BU、RA70%=0.51BU、RA60%=0.74BU、RA55%=0.86BU、RA50%=1.00BU、RA45%=1.16BU、RA40%=1.35BU、RA35%=1.56BU、RA30%=1.81BU、RA25%=2.11BU。将查得的BU值乘以对应稀释度的预稀释倍数D1，即为受检血浆的最终FⅧ抑制物滴度，单位为BU/mL。若原倍血浆（D1=1）的RA>75%，提示抑制物滴度低于方法学检测下限，结果报告为<0.4BU/mL；若最高稀释度（如1:200预稀释）的RA仍<25%，则需进一步加大稀释倍数重新检测，结果超过最高线性范围时报告为“>XXBU/mL”。8.4实验有效性判断满足以下条件的实验结果为有效，可发放报告：①正常对照管C0在0.45~0.55IU/mL范围内；②高低水平质控品测定值在靶值±2SD范围内，符合Westgard质控规则要求；③标准曲线r≥0.98，各校准点偏倚<10%；④至少有一个稀释度的RA落在25%~75%区间内。不满足以上任一条件时，需分析原因重新检测。9.参考区间与临床意义9.1结果判读健康人血浆中无致病性FⅧ抑制物，结果<0.4BU/mL为阴性；0.4~1.0BU/mL为低滴度弱阳性，需结合临床动态监测；>1.0BU/mL为阳性，其中1.0~5.0BU/mL为低滴度抑制物，≥5.0BU/mL为高滴度抑制物。9.2临床应用①血友病A抑制物监测：重型血友病A患者在FⅧ替代治疗的前50个暴露日，抑制物累计发生率可达20%~30%，是导致替代治疗失效、出血风险升高的核心并发症，需按照血友病诊疗指南要求定期检测：前20个暴露日每5个暴露日检测1次，21~50个暴露日每10个暴露日检测1次，之后每年检测2次，若出现出血症状加重、FⅧ输注疗效下降时需随时检测。高滴度抑制物患者需选择旁路制剂（重组FⅦa、凝血酶原复合物）止血或开展免疫耐受诱导治疗，低滴度患者可采用大剂量FⅧ冲击治疗。②获得性血友病A诊断：获得性血友病A年发病率约1.5/100万，多见于自身免疫病、恶性肿瘤、妊娠后女性、药物暴露人群，约50%患者无明确诱因，患者以自发性皮肤黏膜、肌肉、内脏出血为主要表现，APTT延长且不能被正常血浆即刻纠正，FⅧ:C活性降低，FⅧ抑制物阳性是诊断的核心依据，该病出血相关死亡率可达8%~22%，早期诊断可显著改善预后。③鉴别诊断：需与狼疮抗凝物（LA）导致的APTT延长鉴别：LA为磷脂依赖的非时间依赖性抗凝物，Bethesda法检测时孵育2小时后的RA与即刻管无显著差异（RA>90%），且LA筛选、确认试验阳性，高磷脂条件下APTT可纠正；而FⅧ抑制物为时间依赖性灭活，孵育时间越长RA越低，无磷脂依赖性。10.质量控制要求10.1室内质量控制每批次检测必须同时测定低、高两个水平的质控品，采用Westgard多规则质控方案：12s为警告规则，13s、22s、R4s、41s、10x为失控规则。出现失控时需立即分析原因，排查试剂是否变质、仪器温控是否准确、孵育时间是否存在偏差、加样是否存在误差，采取纠正措施后重新检测，质控在控后方可发放报告。10.2室间质量评价每年参加国家或省级临床检验中心组织的FⅧ抑制物室间质量评价活动，质评标本测定偏倚需<15%，出现不合格结果时需开展根本原因分析，采取纠正及预防措施，持续改进检测质量。10.3关键环节质量控制①严格控制孵育温度与时间：温度每偏离37℃1℃，抑制物灭活效率变化约10%；孵育时间每偏差10分钟，结果偏差约15%，必须使用经校准的温度计全程监控温度，准确计时。②严格控制反应体系pH：pH<7.0或>8.0时FⅧ会快速变性失活导致假阳性，严禁使用过期、pH异常的试剂。③避免凝血激活：严禁使用玻璃试管，采血过程避免组织损伤，标本避免反复冻融，防止内源性凝血途径激活消耗FⅧ导致假阳性。④干扰物处理：对于含肝素、DOACs的标本，必须使用特异性中和剂处理后再检测，避免抗凝药导致