PCR技术原理PPT课件

1、RT-PCR技术,reversetranscriptionPCR,1,-,RT-PCR的基本原理,RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。是一种快速、简单、敏感性极高的检测RNA的方法。RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。,2,-,逆转录酶,反转录酶(Reversetranscripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应常用的逆转录酶：鸟类成髓细胞性白细胞病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)反转

2、录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒(moloneymurineleukemiavrius,MMLV)反转录酶。,引物,引物(primer)，是指与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，本质是一小段单链DNA片段，作为DNA复制的起始点。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。,PCR扩增,RT-PCR方法,提取RNA,合成cDNA,4,-,5,-,PCR特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性)-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至9398一定时聚合酶链式反应间后

3、，使模板DNA双链或经pcr扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合;模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至3765，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于7075，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。,6,-,RT-PCR技术,1,一步法,反转录和PCR扩增在同一管内,7,-,2,两步法,将反转录与PCR分两步进行a.先将RNA反转录cDNAb.再以cDNA为模板用引物进行扩增,8,-,一步法,优点：步骤简单、快速，灵

4、敏度高缺点：以RNA为模板，容易降解，每次扩增都需冻融RNA，对RNA保存不利,优点：模板是cDNA，而不是RNA，保存方便，不容易降解，可控性强，遇到问题相对好分析缺点：麻烦，成本高,两步法,一步法和两步法的比较,大量样品分析,检测多种目的基因,9,-,琼脂凝胶电泳法,结果分析,根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，进行分析。,条带的宽度,荧光的亮度,PCR电泳图,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火基因特异性引物设计较差,提高反应的温度和特异性提高引物的特异性,可能原因,解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高PCR反应中引物过多循环数过多退火温度过低,常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量减少PCR的循环次数提高退火温度,可能原因,解决方案,