CHAPTER 8 分子克隆载体

1、分子克隆载体 The vectors in the molecular cloning,Chapter 8,Chapter8 分子克隆载体,质粒载体 噬菌体载体 人工染色体载体 表达载体,Vector,载体：将外源DNA或基因携带进入宿主细胞的工具称为载体 特征： 能够自我复制(具备复制原点) 酶切位点 选择标记 较高的拷贝数,载体介绍,plasmid: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to 200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cell

2、s.,第一节 质粒载体,1.质粒的复制 复制起始区和顺式作用元件 2.质粒的拷贝数 严谨型和松弛型,一、质粒的基本特征,3.质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存(不能共用同一复制系统)。 4.转移性 质粒可通过细菌结合的作用转移到新宿主细胞内。,一、质粒的基本特征,1.选择标记基因 用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 最广泛使用的是抗生素基因：ampr，tetr，kanr，neor等。,二、标记基因,2.筛选标记基因 用于区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒。,二、标记基因,选择标记和筛选标

3、记,(1)-互补 是指lacZ (-半乳糖苷酶)基因上 缺失近操纵基因区段(Operator区)的突变体 与 带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶的突变体 之间实现互补。,2.筛选标记基因,当载体带有lacZ调节序列和编码-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺失其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们相互协作则可形成有酶活性的蛋白， 在诱导物IPTG存在下，细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)培养基上形成蓝色菌落， 当在质粒上插入外源DNA，使-半乳糖苷酶N末端失活，从而就不能进行-互补，因此带有重组质粒的细菌

4、产生白色菌落。,-互补原理,Recreated vector: blue transformants Recombinant vector: containing inserted DNA: white transformants,Recreated vector (no insert),Recombinant vector (contain insert),lac操纵子 调节序列,-半乳糖苷酶 N末端146个 氨基酸序列,IPTG,载体上能 合成N末端,-半乳糖苷 酶缺陷型细胞,有活性的 -半乳糖苷酶,互补,在含X-gal培养基 上显蓝色菌落,插入外源DNA -半乳糖苷酶,IPTG,载体上不

5、能 合成N末端,-半乳糖苷 酶缺陷型细胞,不互补,无活性的 -半乳糖苷酶,在含X-gal培养基 上显白色菌落,(2) 插入失活,质粒pBR322具有tetr基因和ampr基因，当外源DNA插入tetr基因后，导致tetr基因失活，只有ampr抗性。,1.克隆载体 主要用于克隆和保存DNA片段。 2.表达载体 来源于克隆载体，增加了强启动子等元件，有利于表达产物分泌、分离、纯化,三、质粒载体的种类,克隆载体,克隆载体,表达载体,第二节 噬菌体载体,1.基因组大小：双链DNA，48,502bp 2.感染宿主后进入： 容原状态，将噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体中，并随宿主的繁

6、殖传递给子代。 裂解循环，大量复制并装配成子代噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。,一、噬菌体的分子生物学,1. phage Life cycle,viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in length Linear or circular genome (cos ends), phage,Lytic phase (Replicate and release),Lysogenic phase (integrate into host genome), replacement vector,Replace the nonessential region

7、of the phage genome with exogenous DNA ( 20 kb) high transformation efficiency (1000-time higher than plasmid), replacement vector,2. Packing with a mixture of the phage coat proteins and phage DNA-processing enzymes,Ligation,3. Infection and formation of plaques,Plaques(噬菌斑): the clear areas within

8、 the lawn where lysis and re-infection have prevented the cells from growing.,Recombinant l DNA may be purified from phage particles from plaques or from liquid culture.,主要利用噬菌体的生物学特性来作筛选标记。 1、基因组大小 2、lacZ基因 3、cI 基因失活 4、Spi筛选,二、噬菌体载体的筛选标记,1基因组大小 重组噬菌体的基因组DNA太大或太小会影响其存活能力。 当基因组DNA长度为野生型噬菌体基因组DNA的7810

9、5%时，不会明显影响存活能力。 野生型噬菌体基因组 DNA 为48kb ，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内。,二、噬菌体载体的筛选标记,2lacZ 基因 lacZ 基因也可用于噬菌体载体，通过插入或替换载体中的-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。,二、噬菌体载体的筛选标记,3基因c失活 基因c是噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达。 c基因的表达促进噬菌体进入容原状态，基因c产物活性受到影响会促进噬菌体进入裂解循环。 如果外源DNA片段插入基因c中，将高频率地使 hfl 突变E

10、.coli进入裂解生长状态。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。,二、噬菌体载体的筛选标记,4Spi 筛选 野生型噬菌体在带有P2原噬菌体的容原性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对P2噬菌体的干扰敏感。 如果噬菌体缺少两个参与重组的基因red 和gam ，同时带有chi 位点，并且宿主菌为 rec+，则可以在P2容原性 E.coli 中生长良好，噬菌体的这种表型称作 Spi- 。 因此，通过噬菌体载体DNA上的red和/或 gam基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组噬菌体。,二、噬菌体载体的

11、筛选标记,1、通过裂解过程增殖载体 2、载体与外源DNA的酶切 3、外源DNA与载体的连接 4、重组噬菌体的体外包装 5、包装噬菌体颗粒的感染 6、筛选,三、噬菌体载体的克隆原理及步骤,第三节 人工染色体载体,黏粒载体 酵母人工染色体载体(YAC) 细菌人工染色体载体(BAC） P1人工染色体载体,关于人工染色体载体,人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 特征：插入片段的大小接近染色体大小(40kb-400kb)。,1.黏粒的结构 包括质粒复制起点(ColE1)、抗性标记(ampr)、cos位点，大小5-7kb。 2.用途 克隆较大片段的DNA，可达45kb 可

12、在单个重组体种克隆和增殖完整的真核基因 可克隆和分析组成某一基因家族的真核DNA区段,(一)黏粒的结构特征和用途,一、黏粒载体,1.外源片段与载体连接。黏粒载体cos位点通过黏端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与噬菌体包装蛋白混合时，噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到噬菌体颗粒中去。 2.重组噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组 DNA就象噬菌体DNA一样被注入细胞并通过 cos位点环化，这样形成的环化分子含有完整的黏粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。 3.再用带有含抗生素的培养基挑选重组黏粒的细菌。,(二)黏粒

13、载体的工作原理,二、酵母人工染色体载体,YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；含16条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14106bp；具真核mRNA的加工活性。,在YAC载体中最常用的是pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。 但是，为了方便制备YAC载体， YAC载体以环状的形式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。,1YAC人工染色体载体的复制元件和标记基

14、因,YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括： 复制起点序列即自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)、 用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere, CEN)和两个端粒(TEL)。,1YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因,(1)端粒重复序列(telomeric repeat，TEL)：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。 (2)着丝粒(centromere，CEN)：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中

15、起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。 (3)自主复制序列(autonomously replication sequences，ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。,YAC载体结构,主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。 与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。 带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因s

16、up4的载体存在于细胞中时，可抑制 ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。,YAC 载体的选择标记,2YAC 载体的工作原理,当用BamH切割成线状后，形成一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件。 对于BamH切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoR或Sma切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。,装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因 sup4插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转

17、入到酵母细胞后形成白色菌落。 YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。,2YAC 载体的工作原理,三、 细菌人工染色体载体,基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和结合过程的蛋白质。 BAC大小7.5kb，复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS、启动子DNA复制的由ATP驱动的解旋酶RepE，以及3个确保低拷贝并使质粒精确分配到子代细胞的基因parA、 parB、 parC。,1BAC载体及其特点,低拷贝可避免嵌和体的产生 减少外源基因的表达产物对细胞的毒副

18、作用 标记基因为氯霉素抗性基因 可通过-互补筛选重组子 设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA片段体外转录的SP6启动子和T7启动子 可插入片段平均120kb，最大可达300kb,BAC载体特点,BAC工作原理与其他常见质粒载体相似。 不同之处： 大片段DNA需要脉冲场凝胶电泳分离。 拷贝数小，制备难度大。解决方案？ BAC文库构建的关键步骤： 大片段DNA的制备：包埋、酶切、电泳 高质量BAC载体的制备：纯度和去磷酸化 保存：可用96孔细胞培养板，以甘油菌的形式长期低温保存。,BAC工作原理,四、P1噬菌体载体和 P1人工染色体载体,1P1 噬菌体载体 是 Sternbe

19、rg 基于P1噬菌体构建的，与黏粒载体工作原理比较相似的一种高通量载体。 含有很多P1噬菌体来源的顺式作用元件，能容纳 70100kb 大小的基因组DNA片段。,复制元件：P1噬菌体的质粒复制子和裂解性复制子 环化和包装信号：两个loxP重组位点和包装识别位点pac，用于重组分子的体外包装 标记基因：kanr，果聚糖蔗糖酶基因sacB 克隆位点:在sacB内部插入了一个小片段，含有BamHI位点，两端各有一个SP7和T7启动子。 填充片段：11kb的腺病毒DNA填充片段,P1噬菌体载体的组成,先将P1噬菌体载体用ScaI切成线状， 再用BamHI消化， 同时基因组DNA用Sau3A I或Mob

20、I部分酶切，回收70100kbD 酶切片段， 将酶切片段与载体连接， 然后用P1噬菌体包装蛋白进行包装，再感染大肠杆菌。 重组DNA注射到表达Cre重组酶的大肠杆菌后，线状DNA分子通过载体的两个loxP位点之间的重组而发生环化，将感染的细胞置于含卡那霉素和5蔗糖的培养基上筛选。,P1噬菌体载体的工作原理,结合了P1载体和BAC载体的最佳特性，包括阳性选择标记sacB及噬菌体P1的质粒复制子和裂解性复制子。 除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在cre-loxP位点使用位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电穿孔的方法导入大肠杆菌中，并且以单拷贝质粒状

21、态维持。 基于PAC的人类基因组文库插入片段的大小在 60kb150kb之间。,2P1人工染色体(P1 artificial chromosomes),第四节 表达载体,来源于克隆载体，主要用于蛋白质大量表达，便于蛋白质的提取分离纯化。 大肠杆菌表达载体 穿梭载体 整合载体,一、大肠杆菌表达载体,基本骨架具有质粒载体的一般特性： 复制起点、筛选抗性基因、MCS等 表达元件 从分子生物学的角度看，基因的表达涉及哪些元件？,(一)大肠杆菌表达载体的结构,(1)启动子：乳糖操纵子lac基因的启动子及其与色氨酸合成操纵子中trp启动子拼接形成的杂合启动子tac或trc，都受IPTG诱导；T7噬菌体的启

22、动子；噬菌体的PL启动子。 (2)终止子：当遇到茎环结构或者因子介导的终止信号时转录终止。,2、表达元件,(3)核糖体结合位点： 核糖体必须在转录出来的mRNA上找到核糖体结合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列，才能启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。 一般是载体上预先转载有RBS位点，同时ATG与RBS位点之间的距离符合翻译起始的要求，一般间隔3-11bp。,2、表达元件,表达载体,Ptac,复制起始位点,多克隆位点(MCS),抗性基因,(1)直接表达 直接转录翻译目的基因ORF的氨基酸序列 (2)融合表达 通过将两个或多个基因的ORF按一定顺序连接在一起并通过表达而形成

23、融合蛋白。 主要是为了便于目的蛋白的分离和纯化或分泌表达。,3、表达形式,在可控制的条件下表达，这种控制往往是通过诱导来实现。 一般对启动子进行诱导表达，可防止某些有毒产物对细胞的毒害。 化学诱导 温度诱导,4、表达的控制,1、Lac及tac启动子，在IPTG诱导下启动转录。在没有诱导物时，宿主细胞表达的lac阻遏物阻断转录的启动。 2、噬菌体PL启动子受cI基因产物的调节，cI基因产物阻遏转录的启动。为了达到控制表达的目的，容原性噬菌体上的cI基因是温度敏感的，在低温下(30)，cI基因产物阻遏PL启动子的转录，在高温下(40-45)失去活性，PL启动子的转录不受抑制。,诱导表达的例子,表达

24、载体pET-5a是典型的pET载体，其在载体的基本结构的基础上加入了T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。 当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。,(二)利用T7噬菌体启动子的表达载体,T7噬菌体启动子,T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，因此宿主菌株自身必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶，常见的宿主菌株是BL21(DE3)。 当pET载体进入BL21(DE3)后，lacI基因表达产物抑制T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达，目的基因无法启动表达。当存在IPTG后，使抑制物失去抑制作用，从而可以启动目的基因的表达。,T7噬菌体启动子的表达

25、载体工作原理,用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 (Tag)，常用： 谷胱甘肽转移酶 (glutathione S-transferase, GST) 六聚组氨酸肽 (polyHis-6) 蛋白质A (protein A) 纤维素结合位点 (cellulose binding domain)等。,(三)表达融合蛋白的表达载体,GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列(谷胱甘肽转移酶基因和凝血蛋白酶(Thrombin)切割位点的编码序列)。 当外源基因插入到MCS后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 GST是来源于血吸虫的小分子酶(26kDa)，

26、在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。,1.表达GST融合蛋白的表达载体,谷胱甘肽转移酶基因,凝血蛋白酶,将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱， 当表达融合蛋白的细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。 然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。 再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有 Xa 因子（Factor Xa）和肠激酶。,GST融合表达产物的分离纯化,pET系列载体，主体框架与pET-5a相似，多一个lacI基因，启动子下游含有一段

27、编码6个组氨酸的序列和编码Xa因子酶切位点的序列。 当外源基因插入到BamHI等位点后，在BL21(DE3)菌株中可表达出带His-6标签的融合蛋白。,2.组氨酸标签表达载体,T7启动子及下游含有His-Tag、Xa因子酶切位点、MCS,多聚组氨酸肽能与2价重金属阳离子结合，如Ni2+离子。 将Ni2+离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。 纯化的融合蛋白再用Xa因子处理可除去标签多肽，从而获得纯化的目的蛋白。,His融合表达产物的分离纯化,1.包涵体蛋白的纯化 表达产物累积形成包涵体，需通过机械法、超声波等方法破碎细胞，再通过离心获得包涵体，然后洗涤，最后用盐酸胍、尿素、SDS等融