固态发酵微生物3章

1、第3章 固态发酵微生物,3.1 固态发酵多菌种培养及特点 3.2 固体种曲扩大培养技术 3.3 固态分批发酵微生物的生长 3.4 固态发酵菌体量的测定,3.1.2传统固态发酵过程的多菌种混合发酵,3.1.2.1固态发酵微生物的多样性 传统固态发酵的特点是天然接种，多种微生物混合发酵，很难做到纯种发酵。原因是：许多固态发酵是一种开放式或半开放式发酵体系，在发酵过程中从各种途径（最主要是空气）中带入大量的微生物。 自然环境、生产原料、水、生产场所、生产用具都会带入微生物，即使以上批的种曲作为种子人工接种，然而这些种曲也不能保证是纯种。,例：茅台酒酿造微生物的来源： （1）独特的地理大环境，对微生物

2、种群的分布也起着关键的作用，这包括： 茅台酒厂所处的位置及其周边的环境、 当地的土壤特征（土壤类型及厚度）、 空气环流、气候环境（温度、降雨、湿度）、 水环境； （2）局部环境，包括： 制曲的场所（顶棚及四周墙壁）、 发酵酒窑的窑泥、糟醅、黄水、 酒曲和酒醅堆积场所； 这些场所常年累月地生产，大量的微生物及其孢子存在于这些场所。 （3）酿酒原料：也是微生物载体。,3.1.2.2 多菌种固态发酵的类型,野生菌多菌种混合型 人工接种与野生形多菌种混合型 人工接种多菌种混合型：,野生菌多菌种混合型： 不采用人工接种，参与发酵的微生物大多是野生型，它们来自生产原料、环境生产、工具或材料、空气； 在同一

3、酒厂的不同局部环境，都存在着种类繁多的不同的微生物菌群。,人工接种与野生形多菌种混合型： 当人们认识到固态发酵中参与发酵的微生物的种类及其变化规律后，便有意识地分离纯化这些微生物，将有益微生物经过人工培养，接种到培养物中； 生产操作过程中，许多环节会带入野生菌，这些微生物对生产没有太大的负面影响，有的甚至对生产有益。故由人工接种微生物和其它野生菌共同发酵还是被人们认可的。 由于生长温度、水分含量和选择性原料等因素，人工接种的微生物具有生长优势，故其它野生菌的带入客观上也不会产生太大的负面影响。,人工接种多菌种混合型： 将纯培养的多种微生物分别扩大培养，先后或同时接种到培养物上，进行发酵。 例如

4、，乌衣红曲，人们认识到主要是红曲菌、黑曲霉和酵母菌是发挥作用的三种微生物，现已都分离纯化到相应的菌种，并应用于乌衣红曲的大规模生产。 但要准确了解发酵过程中有哪些微生物参与发酵，哪些是有益的，哪些是有害的；哪些菌种在哪个生产阶段发挥作用，参与发酵的微生物之间存在什么关系，通过什么手段来知道微生物的种类和数量，这正是发酵微生物生态学的研究重点。,3.2.1.2 酒曲的微生物生态,从微生物的角度来看，酒曲有两个特点： （1）酒曲，一般是多种微生物共同发酵，故可从酒曲中分离到大量的微生物； （2）酒曲中微生物的种类及数量是随培养过程中不断变化的。 微生物种群的演替，除了微生物的相互关系外，还有许多外

5、界因素对产生微生物的影响。如发酵的原料的选用、通风、翻（拌）料、发酵温度、基质的水活度、pH等条件的变化，都对微生物种群及数量的演替产生重要的影响。,酒曲中微生物演替的重要因素-培养温度 在酒曲生产过程中，温度的变化幅度较大。有些高温曲的培养，培养温度一般是从低到高，再从高到低的过程，从最初的30左右升温到最高温度可达到65。因而不耐热的微生物则会大量死亡。另外，霉菌在制曲过程中都可检测出，但主要是在制曲的前期。检出的种类包括根霉、青霉、曲霉和红曲菌。霉菌虽然也不耐热，但有的霉菌可产生耐热的孢子，因而可以留存下来。,温度是影响微生物演替的重要因素（例）： 茅台酒大曲曲坯入曲房前，曲中的微生物主

6、要以革兰氏阴性菌为主，数量达到105个/g，而革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌种类及数量较少。 进入曲房培养后，细菌开始繁殖，由于微生物的发酵作用，曲温逐渐上升，不耐热的革兰氏阴性菌因高温而死亡，而耐热性好的革兰氏阳性菌大量繁殖。如产芽孢的Bacillus属（B. subtilus、B.licheniformis、B. sterthermophilus、 B. thermoglucoseidusuis、 B. amyloliquefacieus）以及Coccus属、Thermoactinomyces属。 到第一次翻曲时，细菌数量达到107个/g。在制曲的后期，微生物数量减少到105-106个/g，但仍

7、以耐高温的芽孢杆菌为主。革兰氏阴性菌只占0.5%。在茅台酒的酒曲中酵母菌在前期的含菌数在总菌数中可达到25%，但当培养温度达到65时，酵母菌几乎全部死亡。这说明制曲培养条件的变化（尤其是培养温度）是影响菌种演替的重要因素。,影响微生物演替因素-酒曲培养基中水分含量 培养前期的酒曲水分含量较高，水活度较大，适合于对水活度要求较高的细菌的生长，随着培养过程曲料水分的不断散发，曲料中的水活度逐渐下降，因而对水活度要求较高的细菌和酵母菌死亡增加。而对水活度较低的霉菌和放线菌的孢子在低水活度条件下不易死亡，故其数量在中期有上升的趋势。如图3-2所示。,影响微生物演替因素-好氧与厌氧状态 有些固态发酵，通

8、风或搅拌是间歇进行的，在通后或搅拌的一段时间内，氧气是充足的，但随着氧气的被消耗，继而转入厌氧发酵，好氧发酵和厌氧发酵周而复始，这对好氧和厌氧微生物的种类及其数量必将产生影响； 也有的固态发酵，由于固态培养基呈疏松状态，在发酵初期，颗粒状物料中的间隙中含有空气，但由于发酵主要是厌氧的，故随着发酵的进行，空隙中的氧气逐渐被消耗掉，从而转入厌氧发酵状态，从而厌氧微生物占据优势。即使在同一块曲内，由于物料所处位置的深浅不同，也会呈现不同的好氧或厌氧状态。,3.4 固体种曲扩大培养技术,固态发酵所需的种子培养，分液体种子培养和固体种子培养两种方式。 种子的固体培养方法是传统特色技术。 宋代北山酒经中记

9、载“以旧曲末逐个为衣”的人工接种方式，即将挑选当年质量好的小曲作为种子，用于下一年的生产用种子。 这说明，古代人们已经创造了固体种子的接种技术。 古代所用的种子，实际上普通方法所生产的，但经过比较后认为质量较好的酒曲。,固体种子优缺点,优点： 可长期保存，有的曲种保存数年其性能也未下降； 可远距离携带或运输，量大时运输成本也低得多； 固体种子培养设施也相对简单，完全可用常规的固态发酵设施； 使用方便，随时可用。 但固体种子生产过程中，如果条件较差，可能会染菌，致使种曲含杂菌数高，这种情况应尽量避免。,人工纯粹扩大培养曲种的过程一般分为三步：试管（或茄子瓶）原种（一级种）三角瓶种子（二级种）曲盘

10、（或种曲机）培养的种曲（三级种）。 在三级种的培养过程中，传统上采用曲盒、竹匾和金属盘，置放于消毒较彻底的培养室内。这样三级种的培养并非是严格的纯粹培养，培养过程中仍有许多机会染菌，操作上也以人工操作为主。,现代则越来越多地采用完全密闭，通入无菌空气的种曲机作为三级种的培养装置，浅盘式或搅拌式固态发酵罐为主要形式。,红曲曲种的培养,试管斜面米饭三角瓶培养成熟曲种低温烘干或晒干一级种一级种无菌水浸泡磨浆制曲种酱（曲种水醋酸=1110.2）曲种酱接种（曲种酱米=6.2100）二级种曲窑培养（曲料装袋，升温培养，45-50，20 h左右）摊薄培养装框浸水（加醋酸，大米质量的0.2%）沥水堆积培养，3

11、6摊薄培养浸二水堆积培养23 h，34浸三水沥干堆积培养翻拌低温烘干二级种。,3.4.3 厚层通风制种曲,一些规模较大或专门生产种曲的企业，采用厚层通风法制种曲。 和成曲培养方法相同。 但目的是培养孢子。故培养基成分及条件有差别。,“曲精” 这是商品化供应的“种曲”，也称为“曲种”。 国内许多中小型酒厂、酱油厂、豆酱厂、面酱厂、醋厂和腐乳厂不具备自行配备种曲的培养条件，“曲精”的生产和供应随之兴旺起来。目前许多供应商可供应各种类型的专用种曲。如酱油专用种曲、豆酱专用种曲、豆豉专用种曲、面酱专用种曲、腐乳专用种曲、白酒或黄酒专用种曲及酿醋专用种曲。 曲精是米曲霉在开放的条件下生产的种曲孢子集合体

12、，而并非是严格无菌操作条件下生产的，故曲精中含有一定的杂菌，因而曲精不能作为三角瓶的种曲，它只能作为种曲用于生产制曲。,3.3 固态分批发酵微生物的生长,菌体量的表示方法： 由于研究者的习惯及研究重点不同，霉菌生长及菌体量的表示方法有多种，很难统一。 下面是一些研究者表示霉菌菌体量的方法：,菌体量的表示方法,菌丝的长度（mm）： 培养皿上霉菌菌丝长度或菌丝体显微镜摄影结果都可用于表示菌体量。 菌落的面积浓度（kg菌体/m2）： 当以培养皿培养菌体时，由于各培养皿的培养基体积相同，故可简化为用面积表示。 质量体积浓度（kg菌体/m3培养基质）： 在一定体积的培养基测得其菌体质量。,菌体量的表示方

13、法,质量比浓度（kg菌体/kg基质）： 菌体和培养基质均以质量表示。而根据培养基质的基准，又分为湿重为基准，干基为基准的两种表示方法。 根据培养基的初始状态和瞬时状态，还有菌体的绝对浓度和相对浓度的表示方法。,菌体的绝对浓度CXA：即菌体量量（X）和培养物的初始质量（W0）比，定义为： 菌体的相对浓度CXR：菌体质量（X）和取样时培养物的质量（W）比，定义为：,菌体生长动力学模型,总体上分为4种类型： 直线关系 指数关系 对数关系 衰减关系,菌体死亡的动力学模型,在固态发酵过程中，当营养条件及生长条件符合时，菌体就不断生长，但随着培养时间菌体的死亡也是不可避免的。在菌体生长的衰亡期，菌体的生长

14、和死亡实际上同时进行。菌体的比生长速率是这两者之差。总的菌体量包括活菌体和死菌体。 假定菌体死亡是按照一级方程进行，则可得到描述菌体的死亡方程：,菌体的净比生长速率：,3.4 固态发酵菌体量的测定,3.4.1固态发酵生物量的特点 固态发酵过程中，如果所采用的微生物是单细胞的细菌和酵母菌，可以将微生物和固态基质分离开来，故直接检测生物量也是可行的；但若所采用的微生物是丝状真菌，由于菌丝体会渗透到固态基质之中，与基质紧密缠结在一起，不易将微生物与固态基质定量地完全分离，故直接检测菌体生物量很难。一般采用间接法检测生物量。,而对于食用菌或药用真菌的培养，由于其菌体的子实体主要部分是直接生长在空气中的

15、，且其形体较大，直接测定其菌体量完全可行。表示菌体量的生长可称其重量或测定其线性长度。 固态发酵生物量的检测方法主要有三种：直接检测生物量； 通过细胞组分的检测间接检测生物量； 通过生物体的代谢活动间接检测生物量。,3.5.2 细胞生物量直接检测法,先分离，再检测 计数法 称重法,3.5.3细胞生物量间接检测法,3.5.3.1通过细胞组分的检测间接检测生物量 3.5.3.2通过核酸的检测间接检测生物量 3.5.3.3通过葡萄糖胺的检测间接检测生物量 3.5.3.4 通过测定含氮量间接检测生物量 3.5.3.5通过菌体代谢活性的检测间接检测生物量,3.5.3.1通过细胞组分的检测间接检测生物量,

16、可用一些间接的方法检测菌体的组成物质，从而估算固态发酵微生物菌体生物量。这些组成物质包括：葡糖胺（glucosamin）、麦角甾醇（ergosterol）、核酸、总糖、蛋白质。 微生物细胞壁或细胞膜具有某些特征性的化合物，它们是在微生物生长过程所形成的，并且具有明显的光谱特征。例如，真菌的细胞壁中葡萄糖胺（glucosamine）的含量丰富，真菌细胞膜中的甾醇含量丰富。这些物质都可用分光光度计法或HPLC法来测定。,要测定生物量，必须首先建立这些组成分与菌体干物质含量的关系式。 纯菌体的干物质，可用膜培养法、琼脂平板培养法和液体培养法获得。然后，测定菌体中的葡糖胺、麦角甾醇等成分的含量，建立其

17、含量与菌体量之间的标准曲线。同时应建立葡糖胺、麦角甾醇等成分的分析方法。,3.5.3.2通过核酸的检测间接检测生物量,核酸在细胞中的含量十分稳定。在代谢上也较为稳定，不易被分解代谢。理论上讲，核酸的含量与生物量具有较好的线性关系。每个细菌的DNA含量平均为8.410-5ng。将一定体积的细菌悬浮液离心，从细菌中提取DNA，求得DNA含量，则可计算出这一定体积的细菌悬浮液所含的细菌总数。,纯菌体中核酸的提取及测定：精密称取0.1g纯菌体，加入5%的三氯乙酸溶液25mL，于80水浴中放置25min，其间不断进行搅拌，取出后置于冰浴中冷却，然后在8000r/m，4离心15min，稀释5倍，以5%三氯乙酸作空白对照，于260nm处测定OD值。核酸浓度C可按照下式计算：C=50 OD260 (g/mL) 取不同的菌体量，测其核酸含量，作菌体量与核酸含量的标准曲线。,3.5.3.3通过葡萄糖胺的检测间接检测生物量,用葡萄糖胺的含量间接表达菌体干重是许多研究者所采用的方法。 葡萄糖胺是几丁聚糖的组成分之一。,3.5.3.3通过葡萄糖胺的检测间接检测生物量 用葡萄糖胺的含量间接表达菌体干重是许多研究者所采用的方法。葡萄糖胺是几丁聚糖的组成分之一。 dos San