质粒DNA的限制性内切酶酶切分析

1、五、质粒DNA的限制性内切酶酶切分析,1. 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性. 掌握对质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 。,949bp,3kb,2. 实验原理,3. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。,1) 寄主控制的限制与修饰现象,上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。 限制与修饰系统是细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细

2、胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于流感嗜血杆菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。,2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类： 型 型* 型,第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核

3、苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切

4、酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产

5、生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是 5G|CG G3 3G GC|G5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。,3） 同裂酶和同尾酶：,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同

6、的粘性末端，这类酶被称为同尾酶 同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。,同尾酶：,如Xba1和Nhe1: 5T|CTAGA3 5G|CTAGC3 3AGATC|T5 3CGATC|G5 5T CTAGA3 5G CTAGC3 3AGATC T5 3CGATC G5 5TCTAGC3 3AGATCG5 这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。,4) 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一

7、个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,4. 酶切反应的设计一般应注意问题: 加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%:酶贮存在50甘油溶液中避免在-20时结冰。甘油浓度大于12时，降低或抑制某些限制酶的识别及切割特异性。 反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该

8、尽量消化去除。 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，最好选择通用缓冲液，两种酶可同时切割，否则分别酶切。,酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，都会不同程度地影响限制酶的活性。 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。,5. 酶切实验中的注意事项: 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。 终止酶反应可根据

9、需要采用不同的方法： 若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65保温20-30分钟，以灭活酶，终止反应。 酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应。 可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。,6. 实验材料与仪器 质粒 pUCm-T-TaSTK RNase 用含有10mmol/LTris-HCl、15mmol/L NaCl溶液溶解Rnase到10mg/mL，沸水浴15min，保存到-20 BamHI 和 XbaI 核酸内切酶（Takara） 酶解缓冲液(10K buffer) 离心机，水浴锅 10ml，50ml微量移液器，无菌的1.5mL EP管,实验方法和步骤,Total ddH2O K Buffer BamHI X