ITC introduce(等温滴定量热)

1、ITC Introduce（Isothermal Titration Calorimetry）,Isothermal Titration Calorimetry 等温滴定量热,ITC：测定分子相互作用的方法,在一次实验中，ITC可以测定： 结合的亲和力常数（K）； 结合反应中的焓变和熵变（H、S）； 结合位点数（n） 实验也可以测定有多个结合位点的样品,等温滴定量热仪(ITC),神奇的微量热控制功率补偿,Isothermal Titration Calorimetry实验流程,1) 样品池中加入待测大分子； 2) 参照池中加入缓冲液； 3) 将待测配体吸入注射器中； 4) 注射器置于样品池中；

2、 5) 调整温度、搅拌速度和每次注射体积。,典型的 ITC 数据,上半部分表示每次注射采集的数据； 下半部分表示每次注射的释放的热量；（上图中每个峰的面积积分）对滴定抗原与样品池中抗体的摩尔比作图,ITC 理论基础,G=-RT lnKB G = H TS令人郁闷的公式说明了什么？1. 相同的KD有着相同的G；2. 相同的G却有着不同的H与S组合。,引发焓变和熵变的主要因素,Enthalpy (-H) 焓变Hydrogen bonds氢键Ionic interactions离子作用 特异性结合,Entropy (+S) 熵变Hydrophobic interactions疏水作用Conforma

3、tional freedom构象自由度 非特异性结合,ITC 技术的应用领域,分子相互作用： 溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、小分子等等； 工艺过程的开发和控制 酶动力学 药物研发 非生物系统,抗生素抗性的菌种为什么能更好的消灭抗生素,DNA形成了三螺旋？,药物结合的热动力学特征,一样的亲合力，不一样的微观世界,HIV蛋白酶抑制剂开发的“成长烦恼”,ITC在小分子药物结构方面的优化,抗疟疾新药就这样放弃吗？,Kd = 76 nMH = -6.0 kcal/molH = -4.8 kcal/mol-TS = 5.7 kcal/mol,Kd = 0

4、.5 nMH = -5.5 kcal/molH = -4.3 kcal/mol-TS = 2.2 kcal/mol,酶反应动力学的研究,传统酶分析法的局限性（连续分析法，不连续分析法，偶合分析法）1. 溶剂不透明或有混浊并对光谱检测有干扰；2. 天然的、重组的或突变的酶活性低于分析方法的检测限；3. 产物或底物没有光谱基团或荧光基团，或者标记的成本太高或太耗时；4. 不连续分析要求多步进行；5. 不存在直接的偶合反应；6. 偶合分析不精确；7. 底物或酶活性不清楚；8. 蛋白质功能不清楚。,ITC的优点1. 方法开发简单；2. 只要反应过程中有热量变化， ITC即可作为普适的方法；3. 是一项灵敏的技术-噪音水平0.01cal/sec，利用现在的先进仪器可以获得很高的信噪比；4. 无需带荧光或光谱特征的底物参与反应；5. 单次实验即可获得数据；6. 适用于研究多种类型的酶;7. 可以用于不透明的样品;8. 所得数据可以与其它方法进行比较；9. 除了获得热力学数据外还可以获得动力学数据。,酶反应动力学的研究(不一般的ITC曲线）,酶反应动力学应用,ITC ApplicationsEnzyme Kinetics,Typical concentrationsEnzyme