第17讲 抗生素发酵生产工艺学

1、1,第17讲 抗 生 素 发 酵 生 产 技 术 Antibiotics Fermentation Production,2,概述; 生产前期研究; 生产菌改良; 生产工艺过程; 发酵条件的控制; 提取和精制.,主要内容,3,生存竞争说：共生与拮抗，抗生素是拮抗菌分泌的用来与别的微生物战斗的武器。 代谢说：抗生素的产生是由于生物的代谢功能，而抗生素的抗生现象，只是其作用表现。 证据：生产中一定要求纯培养；抗生素生产一般不用诱导物；抗生素生产可加入一些前体；某些微生物在人工合成的培养基才能生产抗生素；有时抗生素的生产也不一定使菌体达到竞争的目的。,1.1 抗生素的生物起源,1. 概述,4,1.2

2、 抗生素的定义和命名 （1）抗生素的定义,早期：一般认为来源于微生物，且主要作用于细菌感染。故认为抗生素(antibiotics)是微生物在代谢过程中产的，在低浓度下就能抑制它种微生物生长和活动，甚至杀死他种微生物的化学物质。由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经把这类物质叫做抗菌素。,5,现在： 来源：随着抗生素研究和生产的发展，新的抗生素的来源正在扩大。可以是微生物、植物（如蒜素、常山碱、黄连素、长春花碱、鱼腥草素等） 、动物（如鱼素、红血球素等）。 但抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。 作用对象：病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞等。

3、因此不能把抗生素仅仅作为抗菌药物。,6,定义： 虽然抗生素已被广泛使用，但是由于抗生素的多样性，关于抗生素的定义在专家中一直存在着分歧。 目前，一个大多数专家所接受的定义是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和动物在内）在其生命活动过程中产生的，能在低浓度下有选择地抑制他种生物机能的低分子量的有机物质。 狭义的定义是：抗生素是低分子量的微生物代谢产物，能在很低的浓度下抑制其他微生物的生长。,7,掌握狭义的抗生素这个概念，需要把握以下几点： A、低分子量 分子量一般不超过几千。如溶菌酶这类酶及其他复杂的蛋白质分子虽然也具有抗菌活性，但由于它们的分子量很大，因而在习惯上不将它们归入抗生素一类。,

4、8,B、天然代谢产物 只有微生物的天然代谢产物才能称为抗生素，通过化学修饰的只能称为半合成抗生素，根据天然抗生素的结构完全采用化学合成方法制造的则称为全合成抗生素。 C、抑制其他微生物生长 是指抑制细胞的繁殖，因此是针对微生物群体而不是个别细胞而言的。这种抑制作用一类是永久性的，例如杀细菌剂和杀霉菌剂等可以将微生物杀死；另一类抗生素只能起到抑制微生物繁殖生长的作用，但不能将它们杀死。,9,D、低浓度 因为在高浓度下，即使是正常的细胞组分，如甘氨酸和亮氨酸，也会对细菌的生长产生抑制作用。基于同样的理由，一些厌氧发酵产物，如乙醇和丁醇，虽然在高浓度下也有杀菌或抑菌作用，也不属于抗生素。典型的抗生素

5、的抗菌活性非常高，只要在微摩尔甚至纳摩尔浓度时就会有显著的抗菌活性。,自从A. Fleming于1929年发现第一种广泛用于医疗上的抗生素以来，至今已找到1万种以上新抗生素（1984）和合成了7万多种的半合成抗生素，但真正得到临床应用的常用抗生素仅约五六十种。,10,1.3 抗生素的发展简史,历史 1929年，英国弗莱明发现青霉素 二战期间，大规模发酵生产 世界上最早用于临床的抗菌素,11,治疗和发展 我国的发展： 1953年5月1日，建立了第一个生产青霉素的抗生素工厂（上海第三制药厂）； 1958年6月3日，最大的抗生素联合企业建成投产（华北制药厂,石家庄） 目前，多为原料药基地。但在半合成

6、及成品药的剂型方面与国外相比差距很大。,12,1.4 抗生素的分类,抗生素的分类主要是便于研究，不同学科和科研人员因出发点不同有不同的分类体系。 可根据生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物合成途径等方面对抗生素进行分类。,13,1.4 抗生素的分类,1.4.1 根据抗生素的生物来源分类 (生物学家) （1）放线菌产生的抗生素：如链霉素、四环类（如四环素）、大环内酯类（如红霉素）、多烯类（如制霉菌素） 、放线菌素类（如放线菌素D）等。（其中链霉菌属最多，诺卡氏菌属、小单孢菌次之） （2）真菌产生的抗生素：如青霉菌属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黄霉素、头孢菌素）。,1

7、4,（3）细菌产生的抗生素：如多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌等。如多粘菌素。 （4）植物或动物产生的抗生素：从被子植物蒜中制得的蒜素；从动物脏器中制得的鱼素等。,15,1.4.2 根据抗生素的作用对象分类（医生、病理学家） （1）广谱抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G- （2）抗G+的抗生素：如青霉素， （3）抗G-的抗生素：如链霉素 （4）抗真菌的抗生素：如制霉菌素 （5）抗病毒的抗生素：如四环类抗生素对立克次氏体及较大病毒有一定作用。 （6）抗癌的抗生素：如阿霉素,16,1.4.3 根据抗生素的化学结构分类（化学家） 目前已确定结构的抗生素习惯如下分类： （1）-内酰胺类抗生素：包括青

8、霉素类，头孢菌素类等； （2）氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等； （3）大环内脂类抗生素：如红霉素、麦迪加霉素； （4）四环类抗生素：如四环素、土霉素； （5）多肽类抗生素：如多粘菌素、杆菌肽； （6）蒽环类抗生素：如阿霉素、柔红霉素； （7）喹诺酮类抗生素：如环丙沙星、诺氟沙星。,17,natural penicillin R =,CH2-CO-,18,-内酰胺 环,19,两性霉素,Antibiotics are so complex they can only be synthesized in a living system,20,1.4.4 根据抗生素的作用机制分类 此种分类的

9、优点：便于进行理论研究，有助于了解抗生素影响病原体新陈代谢的哪些环节，从而找出治疗的规律，使抗生素的使用更为合理。 （1）抑制细胞壁合成的抗生素：如青霉素。 （2）影响细胞膜功能的抗生素：多烯类抗生素。 （3）抑制病原菌蛋白质合成的抗生素：四环素。 （4）抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素C。 （5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素。,21,1.4.5 根据抗生素的合成途径分类 （1）氨基酸、肽类衍生物抗生素：如青霉素类、头孢菌素等寡肽抗生素。 （2）糖类衍生物抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。 （3）以乙酸、丙酸为单位的衍生物抗生素：红霉素等丙酸衍生物。 问题

10、：一种抗生素可能有几种机制，机制非常清楚的不多。,22,1.5 抗生素的剂量表示法及抗菌谱,1.5.1 抗生素的剂量表示法 抗生素应用时剂量小，因此除重量外，常用特定的效价单位表示 （1）稀释单位：无法制得纯品，最初的表示方法，一定基于稀释法定的基准单位。 一个青霉素的效价单位：为能在50mL肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株的发育的最小青霉素剂量。 一个链霉素效价单位：能在1mL肉汤培养基中完全抑制大肠杆菌（ATCC9637）发育的最小剂量。,23,（2）重量单位：以抗生素的有效成分（生理活性成分）的重量作为抗生素的基准单位。（大多数使用） 一般定义1mg=1400单位。对于各种酸、

11、碱、盐，指定其中的一个。如链霉素、氯霉素等以游离碱计，又如金霉素、氯霉素以盐酸盐计。,24,1.6 抗生素的体外抗菌作用 判断药物有无抗菌作用及其抗菌作用的强弱，有体外和体内两种试验方法。一般先进行体外抗菌试验，若发现药物有抗菌作用，可再进行体内抗菌试验。 体外抗菌试验主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，所以也称为药敏试验，常用最低抑菌浓度（MIC）表示，是指药物完全抑制某种微生物的最低浓度。 （1）抑菌、杀菌作用 抑菌作用：抗生素存在时细菌的繁殖受到抑制，去除抗生素后，对细菌的抑制作用消失。 杀菌作用：对细菌的不可逆损害，导致死亡。 （2）菌种的最低药物敏感度测定。,25,最小抑菌

12、浓度（MIC）：培养24h以最低浓度无菌体生长者。用来表示抗生素的抗菌活性作用，单位是g/mL。 最小杀菌浓度（ MBC）：次代继续孵化24h以最低浓度无菌生长者。即当药物浓度在稍高于MIC值浓度下的抑菌作用是不可逆的，称为杀菌作用。最低抑菌浓度与最低杀菌浓度可以相同，也可以有所不同。 最低杀菌浓度的确定即依次将未见细菌生长的各管培养物各吸取0.1mL涂布于合适的琼脂培养基平板上，在规定的温度下培养1824h，平板上的菌落数小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。 （3）抗菌谱：某种抗生素所能抑制或杀灭病原体的范围，称之为该种抗生素的抗菌谱。,26,1.7 医疗用抗生素应具备的条件 （

13、1）抗生素在低浓度下对多种病原菌有效高效 （2）难以使病原菌产生耐药性交叉用药，防止最重要 （3）较大的差异毒性副作用小,27,产生菌的筛选； 抗菌性试验； 提取、精制、鉴定； 毒性试验； 药理和临床试验。,2生产前期研究,28,Agar diffusion assay,agar plate 琼脂培养基,29,分 析 仪 器 Analytical instruments,现代分析仪器： 核磁共振 毛细管电泳 气相色谱 高效液相色谱 质谱,Modern analytical instruments: Nuclear magnetic resonance (NMR) Capillary elect

14、rophoresis(CE) Gas chromatography (GC) High performance liquid chromatography (HPLC) Mass spectroscopy (MS) AutomationSensitivityAccuracy 自动灵敏准确,30,人工诱变法： 紫外线、X-线、r-线照射 亚硝基胍、亚硝酸、秋水仙素、氮芥等诱变剂处理,3. 抗生素生产菌改良,31,基因工程 Genetic Engineering,Recombinant DNA Technology （DNA重组技术）,克隆,32,Strain Improvement Scale-

15、up,Strain 出发菌株,Agar plate 平板技术,Primary shake flask Evaluation 摇瓶培养,Secondary shake flask evaluation different media 二级摇瓶培养 各种培养基,Lab fermentor evaluation Production Condition 小型发酵罐 模拟生产条件,Master cell bank,Working cell bank,Inoculum Development 菌种扩大培养,Pilot plant Evaluation 中试生产,Production Evaluation

16、 生产,6000,300,30,3,1,Possible recycle,33,Scale-up（比拟放大）,models,EL Gadden Jr,模 拟,34,摇瓶发酵 Shake-flask fermentation,装液量：10% (-250ml) 间歇培养 温控受限制 代谢碳水化合物慢 常压 缓冲液控制pH 在线取样难 容量减少 瓶壁上结垢 无需消泡 搅拌受限制 无法控制溶解氧,35,搅 拌 罐 发 酵 Stirred tank fermentation,10-100,000升容量 间歇和补料培养 连续控制：pH，温度 需要铵盐或氨气 2 大气压 无需缓冲液 在线取样易 补料,容量增

17、加 生长均匀一致 需消泡 多种搅拌 控制溶解氧:通气,加压,36,摇 瓶 发 酵 Shake-flask,装液量：10% (250ml) 间歇培养 温控受限制 代谢碳水化合物慢 常压 缓冲液控制pH 在线取样难 容量减少 瓶壁上结垢 无需消泡 搅拌受限制 无法控制溶解氧,10-100,000升容量 间歇和补料培养 连续控制：pH，温度 需要铵盐或氨气 2 大气压 无需缓冲液 在线取样易 补料,容量增加 生长均匀一致 需消泡 多种搅拌 控制溶解氧:通气,加压,搅 拌 罐 发 酵 Stirred tank,37,菌种 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品包装,4. 抗生素生产工艺过程 A

18、ntibiotics Production Processing,38,A scheme of the material flow in an antibiotic production,连消,发酵罐,缓冲罐,种子罐,39,发酵生产原料 Materials for Fermentation,Carbon source: Beet & cane molasses Glucose, lactose, starch Ethanol, methanol Glycerol Maltose syrup, corn syrup Cottonseed oil, peanut oil, soy oil Lard

19、 oil Methyl oleate Tallow,碳源: 甜菜和甘蔗糖蜜 葡萄糖，乳糖，淀粉 乙醇，甲醇 甘油 麦芽糖浆，玉米糖浆 绵籽油，花生油，豆油 猪油 油酸甲酯 油脂,40,氮源: 绵籽粉 玉米粉和玉米浸出液 大豆粉和大豆面 花生粉 菜籽粉 牛血，酪蛋白水解液 乳清 鱼粉 酵母 酵母膏 肉粉和骨粉,Nitrogen source: Cotton seed meal Corn meal & steep liquor Soybean meal & flour Peanut meal Rapeseed meal Beef blood, Casein hydrolysate Whey Fis

20、h meal Whole yeast Yeast extract Meat & bone meal,发酵生产原料 Materials for Fermentation,41,培 养 基Media for Cell Growth & Final production,Components Range % 组 成 Glucose/ sucrose 3.0-5.0 葡萄糖/ 蔗糖 Starch 淀粉 3.0-5.0 Corn steep liquor 3.0-5.0 Calcium carbonate 0.5-1.0 碳酸钙 Phosphate 磷酸盐 0.1-0.5 Ammonium sulpha

21、te 0.1-1.0 硫酸胺 Urea 尿素 0.1-0.5 Oil 油 0.1-0.5,Fermentation 发酵培养基,Components Range % 组 成 Glucose 0.5-1.0 Starch 0.5-5.0 Corn steep liquor 5.0-8.0 玉米浸提液 Soy flour 1.0-5.0 Phosphate 0.1-1.0 Ammonium sulphate 0.5-1.0 and fed periodically Oil 1.0 and fed continuously Corn syrup fed continuously 玉米糖浆 连续加料,

22、Tank seed 种子培养基,42,Stirred tank Fermentation 搅拌发酵,43,5. 发 酵 控 制Fermentation Control,Pressure probe,Level probe,pH probe,Temp. probe,DO probe,Antifoam,Acid/Base,Cooling,Air/agitation,Sugar/Oil feed,44,Scale,Weight Signal,Pump Speed,Amplifier,Controller,Supervisory Computer,Flow Rate Control 流量控制,45,发

23、 酵 控 制 Fermentation control,46,菌种 (strain)：产黄青霉菌 (Penicillium chrysogenum) 孢子培养 (spore cultivation)：25 C, 6-7 d 种子培养 (seed cultivation)： 25 C，2-3 d 发酵培养 (fermentation)： 22-26 C,6-7 d 加糖控制 (sugar feeding)：残糖降至0.6,青 霉 素 发 酵 (1) Penicillin Fermentation,47,补氮 (nitrogen feeding)：氨控制在 0.01-0.05 前体 (precur

24、sor)：残余苯乙酰胺 0.05-0.08 温度控制 (temperature)：前期 25-26 C 后期 23 C 通气与搅拌 (aeration & stir)：1 : 0.8 VVM 泡沫 (foam)：天然油脂, 如豆油,青 霉 素 发 酵 (2) Penicillin Fermentation,48,Penicillin Fermentation Profile 变化曲线,49,生产方法： 6.1、生物合成法： 传统方法 “工程菌”制造法 细胞融合技术法 6.2、化学合成法； 6.3、生物合成加化学合成法。,6 抗生素的生产方法,50,6.1、生物合成法： 传统方法 大多数抗生素是由放线菌和霉菌产生的。菌种是通过从土壤中分离、筛选获得，一般采用深层通风搅拌发酵罐生产。 传统