HPLC-NMR联用技术及其应用示例PPT课件

1、1,HPLC-NMR技术及其应用示例,温新潮 201381800013,2,内容摘要,3,1、HPLC-NMR出现的意义,如果在核磁共振仪器前加一个一级色谱分离设备把直接样品分离后再送入NMR中扫描，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度。,4,1、HPLC-NMR出现的特点,5,2、HPLC-NMR的发展过程,6,3、HPLC-NMR装置,典型的HPLC-NMR联用装置是由泵、注入阀、色谱柱和紫外检测器组成LC系统，通过2-2.5m长的特制毛细管连接到NMR液相探头上。可以将NMR视为HPLC的特殊检测器，其化学位移、积分强度和谱线分裂情况能提供丰富的定量定性信息。位于NMR探头底部的阀门

2、用来控制NMR测试是在停流状态下还是在连续流动状态下进行。,7,传统NMR探头与HPLC-NMR探头比较,NMR探头是装置中最关键的部分。传统的NMR探头样品管在一个与测量线圈相连的玻璃插件内旋转。 HPLC-NMR探头是一个不旋转的直接固定在射频线圈上玻璃管构成的，他处于传统探头玻璃杜瓦瓶中心，玻璃管内径为2.3或者4mm。玻璃壁长度至少超过质子检测线圈（18mm），并与之平行，同时向两端逐渐变细。由于射频线圈直接固定在检测池在玻璃管上，NMR线圈的体积和试样体积比，既所谓的填充因子接近最佳值，这种类型的NMR测定探头原则上是最灵敏的。,8,4、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技术问题

3、以及解决方法,（一）HPLC高浓度溶剂的NMR信号抑制,9,4、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技术问题以及解决方法,与HPLC的常规用量相比，NMR检测所需的样品量是非常大的。在HPLC-NMR操作中，较大的HPLC进样量和较长的HPLC流动时间会造成色谱峰的展宽。,理想的进样量应尽可能小地取得好的HPLC的分辨率，同时又应该尽可能大地满足NMR检测的需要。这个问题可以通过选择最佳进样量以及优化其他操作条件来部分的解决。,（二）避免损伤色谱分析的分辨率,10,4、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技术问题以及解决方法,（三）NMR高灵敏度的需要,NMR的灵敏度大大低于HPLC的常规

4、检测器（如紫外检测器等）灵敏度，如何解决这个矛盾是解决HPLC-NMR技术发展的主要难题之一。,利用SFC等方法浓缩样品 降低探头温度,11,4、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技术问题以及解决方法,超临界流体是指处在临界温度，临界压力状态下的物质，这时物理性质介于液体和气体之间。超临界流体技术能够弥补气相和液相分离存在的缺点。 作为流动相的CO2具有廉价，安全和易获取等优点，对低极性或中性物质具有较好的溶解性，适合分析热敏感组分，同时，作为流动相的CO2没有H信号，因此不需要考虑水峰抑制问题。可以一次性完成从样品分离提纯到峰的检测，结构定性和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息，从而

5、提高效率和研究灵活性。,利用SFC等方法浓缩样品,12,4、HPLC-NMR在实际应用中面临的主要技术问题以及解决方法,利用高温超导薄膜材料而制成的超低温探头，当样品温度由温控单元控制时，采用闭环或者开环制冷系统使超导线圈温度降低到25K,消除了图谱的电噪声，这相当于常规5mm探头而言，其潜在的灵敏度可以提高8-10倍。,降低探头温度,13,5、HPLC-NMR操作模式和技术,14,5、HPLC-NMR操作模式和技术,HPLC的流动是连续的，不受NMR取样的影响，当每一组分由HPLC流经NMR检测池时仪器时就会扫描出这个组分的图谱。使用这种方法可以再很短的时间内完成样品分析并得到各个组分分子结

6、构方面的信息。因此连续流操作方式在一些要求较快得出检测结构的分析得到了应用。但是这种模式一般只适用于1H和19F测试。,连续流动模式,15,5、HPLC-NMR操作模式和技术,驻流模式：让溶液停留在检测池中进行测试，当所需要组分的保留时间已知，或者HPLC-NMR采用灵敏的在线检测器时，可以采用这种方法。,驻流模式,16,5、HPLC-NMR操作模式和技术, 时间分割驻流方式。这时最早使用的一种驻流操作方式。 具体方法是：通过紫外检测器确定了色谱峰位置之后，在适当的时间停止色谱流动，使色谱峰准确的停留在NMR检测池中，同时使用NMR进行较长时间的扫描（可达数小时），并且根据需要可以做COSY/

7、TOCSY等二维NMR谱图。一个谱峰扫描完毕后，可以继续色谱流动。这样就相当于将整个色谱流动过程分为若干段，一段段进行NMR分析。 就目前来看，这种操作方式的主要缺点是：由于色谱流动相阶段性停止，大大增加了分离时间，从而可能会使色谱峰展宽，分辨率下降。,驻流模式,17,5、HPLC-NMR操作模式和技术, 脱机驻流方式。 脱机驻流操作方法是在色谱分离的过程中，将各个色谱峰的一部分转移到不同毛细管中，然后再分别进入NMR检测池中进行扫描分析。在整个过程中，色谱峰并没有任何停顿，所以解决了使用“时间分割”驻流方式所带来的色谱峰展宽的问题。,驻流模式,18,5、HPLC-NMR操作模式和技术, UV

8、检测器控制NMR取样。 使用这种方式进行操作必须有相应的软件支持。在这种操作方式中，可以选择手动和自动两种模式。当选用自动方式时，系统会通过UV检测器监测HPLC流出的较大色谱峰，并自动取样进入NMR中扫描。如果选用手动方式，仪器可按用户设置的峰位置、大小等参数有选择地对各组分进行取样、扫描。 这种操作方法自动化程度高，使用简单，目前正处在发展之中。,驻流模式,19,6、HPLC-NMR在在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究,（1） 药材的提取及初步分离,20,6、HPLC-NMR在在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究,（2） LC-NMR联用仪及实验条件,采用Varian公司的LC-NMR联用仪，其

9、中高效液相色谱仪为Prostar-230， 分析柱为Inertsil ODS-3柱 (250 46 mm) 流动相为D2O，CH3CN，采用梯度洗脱，其洗脱比例为D2O : CH3CN = 57 : 43 (010 min)， 后逐渐增加乙腈的比例至40分钟时达到：D2O : CH3CN = 40 : 60 流速为1mL/min，检测器为 Varian Prostar-330二极管振列检测器，紫外检测波长为280 nm 将2mg混合物样品溶于80L乙腈和水的混合溶剂中。,21,6、HPLC-NMR在在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究,（3）实验内容,1.在Mercury-300核磁共振仪上采集普

10、通的混合物的1H-NMR谱内标为TMS，以CD3OD为溶剂采样时间1.5s，累加次数为32次。 2.在INOVA-500 LC-NMR上，用停止流动的方法采集LC-NMR 1H-NMR谱及WEG-COSY谱。进样量为25L， 1H-NMR谱采样时间为1.5s，累加次数为416，WETG-COSY的F1，F2均为60000.0Hznt =24，ni =128，总采样时间为1h7min37s。,22,6、HPLC-NMR在在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究,（4）通过本次实验得到的经验与体会,1HPLC与NMR在对样品量的需求上存在相对的矛盾要想取得较好的HPLC紫外光谱吸收峰线形，样品的进样量要求

11、尽量少这样可保证一个组分的绝大部分保留在NMR探头液池中因为探头液池的体积仅有6L 而过少进样，会使探头液池中液体溶质的含量较低，影响NMR谱的质量，甚至无法获得相应的2D谱 2在溶剂的使用上，采用乙腈和重水较好虽然采用甲醇会降低成本，但是甲醇在核磁谱中水峰压制的效果不如乙腈采用重水可大大降低核磁谱中水峰的强度及降低水峰对样品峰的影响,23,6、HPLC-NMR在在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究,（5）通过本次实验得到的经验与体会,3在我们的实验中，天然产物混台物其成分较复杂，除主要组分外，还含有其它许多小组分，如果不考虑紫外吸收效应，吸收峰线形较好时，其UV谱吸收峰强度达到100A时，可获得较好的1H-NMR谱。 4本实验采用LC-NMR联用技术，使微量天然混合物中的主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了LC-NMR技术的微量、快速的特