课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、,欢迎您走进生物课堂,双流中学 雷治练,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数,专题2 微生物的培养与应用,【课题目标】,研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。,【研究对象】,土壤中能分解尿素的细菌,课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟

2、含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例：,自然界中寻找目的菌株时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,.筛选菌株,原因：,启示：,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，配置合适的培养基。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,作用：,抑制大

3、多数微生物生长 造成有利于该菌生长的环境,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？,固体培养基,此培养基哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素,选择培养基,氮源：尿素（唯一N源）,选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,培养基的氮源只有尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源才能生长繁殖。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,4、该培养基是否具有选择作用？分离原理是什么？,5

4、、该培养基上生长的一定只有分解尿素的微生物吗？,不一定。 有的微生物可利用其它微生物的代谢产物 固氮微生物可利用空气中N2，也可在该培养基上生长。所以需要进一步验证。,6、怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为 唯一氮源 的培养基,牛肉膏 蛋白胨 培养基 （完全培养基）,是,分离分解尿素的细菌,判断该 培养基 有无选 择性,只生长尿素细菌，菌落数少且特征一致,生长多种微生物，菌落数多且特征不一致,是,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜

5、下难以观察；,缺点：,（比实际活菌的数目高）,（有可能多个细菌长成一个菌落，比实际活菌的数目低）,当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。,2.活菌计数法（间接计数法） （1）常用方法：,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(0.1ml)，M代表稀释倍数。,（2）原理：,稀释涂布平板法（活菌数目）。,（3）公式：,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得 平板上菌落数的

6、平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,B,？,在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果的一致性，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,未设置重复组，不具说服力。 在设计实验时，每个稀释度都一定要涂布至少3个平板作为重复组，取其平均值，才能增强实验的说服力与准确性。,一般选择菌落数在30300的 平板,且要考虑重复组结果的一致性。 差距较远的应舍弃，取剩下2个平板的平均值作为统计结果。,为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板中（设

7、置重复组），经涂布培养后，计算出菌落平均数。,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的 平板，且数目应相接近的进行计数。（相差较远 的那组应舍弃，计算接近的2组的平均值即可。）,注意事项：,统计结果用菌落数（不是活菌数）来表示，因为当多个细菌连在一起时得到的只有一个菌落。所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。,是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,设置对照的方法：,空白对照：不给对照组任何处理因素。,条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素。,自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行。,相互对照：不单设对照组，而是几个

8、实验组相互对照。,是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验。（P23）,对照实验：,设置对照的主要目的：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：,一是由于土样不同；,二是由于培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质).,设置对照有多重要？,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，设置对照是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样和培养基进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样（即不接种）的情况下进行培养，作为

9、空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,（三）设置对照,判断培养基是否有杂菌污染：,空白对照：将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用：,完全培养基（营养成分齐全）作对照：接种 后培养观察菌落数目及特征。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。,二.实验的具体操作步骤 .土壤取样 土壤要求：富含有机质（肥沃、湿润） 取样部位：距地表约3-8cm的土壤层 先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲

10、和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 .制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度,三样品的稀释,为什么分离不同微生物要采用不同的稀释度？ 测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？（P24）,结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，对稀释度无把握时可适当放宽范围。同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,原因：土壤中不同微生物的数量（株/kg）不同。,例如：在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为 2185万，放线

11、菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。,目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,细菌：数量最多，稀释度高，为104、105、106 放线菌：稀释度为103、104、105 真菌：数量最少，稀释度低，为102、103、104,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释度的三个重复组的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.取样涂布平板,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时（随培养时间推

12、移菌落数不再增加）的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,.微生物的培养与观察,三.结果分析与评价,四、操作提示,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三制定计划、规划时间,五.课外延伸菌种鉴定 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,原理：,鉴别培养基,培养基+酚红,红色,pH上升,拓展：滤膜法（P26）,以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过计数得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌呈 黑色中心 ,有或无金属光泽,【巩固1】