5 第五章植物花药和花粉培养

1、第五章植物花药(花粉)培养。花药和花粉培养的概念和应用。花粉小孢子发育途径3。花药和花粉培养方法4。单倍体植株鉴定和染色体加倍，花药培养简史，1964:古哈马赫什瓦里南阳金花(曼陀罗)花药培养发育成胚；1967年：通过布尔津尼奇的花药培养获得烟草植株；1973年，中国首次报道利用小麦花药培养获得再生植株。目前，许多作物和经济植物可以通过花粉培养诱导成植物。中国首次成功培育了250种植物中的近1/4。水稻、小麦、青椒、烟草，(1)花粉和花药培养的概念花粉和花药培养是指花药和花粉在培养基上改变它们正常的发育路径，使它们不形成配子，而是经过细胞分裂和分化，最终发育成完整的植株。通过花粉离体培养获得的

2、整株植物称为单倍体植物。首先，植物花药和花粉培养的概念和应用，花粉培养的优点：它可以清除花药中的有害物质，帮助小孢子开始第一次分裂。排除了药壁(2n)、药隔(2n)和花丝(2n)的干扰，从小孢子获得的材料为纯合单倍体。小孢子更均匀地暴露于化学和物理诱变因素，是吸收、转化和诱变的理想材料。小孢子培养可以观察雄核发育的全过程，是进行遗传和发育研究的良好物质系统。小孢子培养可以从每个花药中获得更多的单倍体。(2)应用花药和花粉培养，在作物育种中诱导单倍体形成，快速获得纯系，缩短育种周期；有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。(诱变和非诱变)用于抗性育种以获得无病毒个体。可以大大缩短育种周期，用于物种进

3、化的研究。在单倍体植株的减数分裂过程中，是否存在同源染色体可以根据形成二价染色体的可能性及其数量和形状来判断，从而可以确定亲本的倍性。对于遗传分析来说，单倍体植株是研究基因特性和功能的好材料。用于分子生物学研究和遗传作图。目前，作图群体主要包括：单交产生的F2群体；不列颠哥伦比亚省人口；RIL人口；DH群体DH群体来源于花粉培养，具有所有等位基因均为纯合的优点，可用于无限期定位新标记。它可以反复测试，适用于定量性状分析。利用自交产生的1020株植物的混合样品，可以准确地进行基因型的分子标记。5。植物基因克隆和筛选，体内小孢子发育途径，花粉植物形态发生途径，2。花粉小孢子发育途径。花药培养，1。

4、选择材料，在花粉发育的适当阶段(通常是四孢子期和单核期)选择花蕾。显微镜下观察花粉发育时期，根据发育时期与芽的大小、外观、形状和颜色的相关性选择合适的芽。(3)花药和花粉培养方法，说明了花药培养过程，选择花药材料的关键是选择处于合适发育阶段的花药，而花粉发育只有在离体培养后才能开始。实践表明，从减数分裂期到双核期，体外诱导孤雌发育是可能的。在大多数植物的花药培养中，成功率最高的时期是单核期，或单核中晚期。2.材料的预处理取适合花粉发育的花蕾进行预处理。低温处理一般为35310天，高温处理一般为3513天。为了防止花蕾失水，可以将花蕾放入装有浸泡过的滤纸的培养皿中进行处理。3.材料的消毒方法与其

5、他组织相同；4.培养1)基本培养基因植物不同而不同，质谱、N6、B5和C17都是有用的。2)添加到培养基中的蔗糖浓度，特别是在早期培养中，高于其它组织培养中的浓度，通常为5%。3)激素的种类和浓度在花药培养中起着重要的作用，并且因植物而异。4)培养模式可以是立体的据报道，液体培养优于固体培养，但在液体培养基中诱导的愈伤组织必须及时转移到固体培养基中。也可以使用双层培养。5)花药培养条件：光照(1218小时，5，00010，000 lx，28)和黑暗(12-16小时，22)交替循环。花药培养的目的是花药中花粉的植株再生，即单倍体再生。因此，花药可以培养几天，然后可以取出花粉，再次培养。(2)游离

6、花粉粒培养法花药有花药壁(2n)、花药隔膜(2n)、花粉(n)等。因此，再生植株可能来自花药壁(2n)、花药隔膜(2n)或由几种花粉(n)形成的嵌合体。然而，在游离花粉粒培养中，再生植株是纯合的。再生植株的材料选择、预处理、消毒、培养基和染色体加倍与花药培养基本相同。差异：花粉收集和培养方法。1.花粉分离收集和纯化花粉分离收集由于花粉被包裹在花药中，因此在培养花粉之前，有必要从花药中分离和收集花粉。方法：1)用自然释放法将花药接种于液体培养基中，使花粉自然释放。2)用玻璃棒通过人工挤压粉碎花药以释放花粉。3)用磁力搅拌器打碎花药并释放花粉。纯化花粉，用尼龙网(孔径2060um)过滤上述三种方法

7、释放的花粉粒，通过去除组织如药壁离心收集花粉(密度梯度离心)，花粉培养，选择幼树芽，2。培养方法1)平板培养2)液体振荡培养3)双层培养4)护理培养5)微室培养6)条件培养基培养。4.白化苗现象严重制约了花粉培养在单倍体育种中的应用。1)白化花粉植株的超微结构特征细胞中存在微核和前质体，但质体发育中途停止，质体中缺乏核糖核蛋白和叶绿体，出现染色体片段。生殖生长和雌核发育不正常，不能完成有性生殖并产生种子。2)白化苗的影响因素和机理，影响因素的内部因素：供体植物的基因型、花药和花粉本身的生理状态，外部因素：低温预处理(410)、培养基成分(蔗糖浓度)、激素水平和类型(高浓度2，4-D)、培养条件

8、(28)和方法、愈伤组织转分化时间(延迟)、机理等3)白化苗的控制，以小麦花药培养为例：主茎和大分蘖穗主要在摘穗期间，幼穗在花粉发育的中后期。花药集中在幼穗轴中部，下部多，上部少。幼穗4在低温下体外预处理24小时。去分化培养通常在暗室中进行。当温度为3032时，愈合率较高，但有许多白化苗。29、培养效果理想。激素通常用2，4-D(2.0毫克/升)6-BA或KT(0.5毫克/升)去分化，蔗糖浓度从11%变为9%蔗糖和2%麦芽糖。应尽早进行转分化培养。5.影响雄核发育和花粉花药培养的因素。1)植物基因型是影响离体单倍体诱导成功的最重要因素之一。不同基因型在培养和植株再生的难度上有很大差异。大白菜小

9、孢子：不同基因型和不同胚产量的水稻花药培养：产生愈伤组织和再生植株的能力不同。2)植物生长条件和生理状态，对今后花粉离体培养有很大影响。一般来说，幼株的花药反应能力较好；在谷类植物中，大田植物花粉愈伤组织的诱导率高于温室植物，主茎和穗的诱导率高于分蘖。在烟草花粉培养中，短光周期(8h)和高光强度(16000Lx)更有利于培养。这可能与激素水平有关。3)不同的基因型(即不同的植物或品种)有不同的花粉发育时期，最适合培养的花粉发育时期一般是从四孢子期到单核期。花粉发育时期的确定：显微镜检查及相关性状；4)预处理的花粉或花药取自植物并直接培养，这通常导致极低的诱导频率。低温、高温、离心、化学物质和辐

10、射等预处理方法可以促进花粉启动，提高再生频率。高低温处理、低温预处理、低温后处理和热冲击处理。饥饿，低温预处理的机制：预处理引起花药和花粉内源激素的变化，从而改变小孢子(花粉粒)第一次有丝分裂的发展方向，进而形成愈伤组织或胚状体。提高小孢子的生活力，延缓降解速度，提高诱导率。它导致小孢子分离，即小孢子从花药中分离出来。因为在低温处理过程中，花药中的薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断了与小孢子的联系。化学处理，高糖：在接种前用高糖预处理花药一定时间，然后转移到合适的糖浓度进行培养，可以大大提高愈伤组织和胚状体的诱导率。甘露醇：秋水仙碱乙烯利，其他预处理，影响小孢子分裂和发育，径向离心磁场，5)不

11、同基因型的培养基成分，不同种类的所需培养基，不同种类和浓度的添加激素。基础培养基中国科学家改进了水稻和小麦的花药培养基，并开发了N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉愈伤组织率显著增加。N6培养基的特点是铵离子浓度低。然后，通过进一步降低铵盐和硝酸盐的浓度，添加生物素，开发出C17和W14培养基，可大大提高小麦花药愈伤组织率。以马铃薯提取物为基本成分的马铃薯培养液目前广泛应用于小麦花药培养，效果良好。一般来说，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而不妨碍花粉的生长；单子叶植物比双子叶植物需要更多的糖。现在发现麦芽糖是小麦培养中最好的碳源。烟草的最适蔗糖浓度为3，水稻为3-6，玉米为12-15。通常，在

12、禾本科植物中，1-5毫克/升2，4-D或NAA常用于诱导花粉愈伤组织的形成，然后将愈伤组织转移到分化培养基中，减少或除去生长素或加入细胞分裂素以诱导植物的器官分化和再生。除2，4-D外，吲哚乙酸和NAA还能诱导胚胎发生和器官形成中的细胞分裂素，常用的有KT和BAP。在培养基中加入活性炭可以促进花药培养。氨基酸和其他有机物质对花药培养也非常重要。谷氨酰胺有利于大麦和小麦的花药培养。有些作物对酸碱度有特殊要求，曼陀罗：5.8；油菜：6.2，6)培养方法和条件，培养方法：固体、液体、半固体、双层培养温度，因基因型不同而不同。光影响小孢子的生长和发育。种植密度：群体效应；7)花药壁功能、正效应和负效应：花药壁内源生长素梯度在花粉胚发育中起重要作用。花药损伤释放的有毒物质对花粉培养有害。(4)单倍体植株的鉴定和染色体加倍(1)单倍体植株的鉴定(1)直接染色体计数法：在细胞分裂旺盛的点，如根尖和茎尖，直接计数细胞染色体。2.间接