09中药药理实验方法学2.ppt

1、,第三节 中药药理实验设计的基本原则,1. 对照,（1） 正常对照组（空白对照、阴性对照） （2）模型对照组 （3）阳性对照组 意义：检验实验体系是否可靠 粗略估计受试药与对照药相比，作用强度与特点上有哪些差异。,（4）假手术对照组 有时可以替代正常对照 （5）自身对照 观察同一个体给药前、后的区别 .,2. 随机： 目的： （1）避免非研究因素影响。 （2） 除研究因素外，提高各比较组的其他因素的均衡性、可比性。 （3）满足统计学假设检验的要求。,抽签随机法： 例：30只小鼠，要求随机分为3组： 可先将30只小鼠按1至30编号，做1-30号签，充分混合号签后，随机各取10枚为一组。,随机数字

2、表法：取P.187,表221，第16行,顺序号: A组：1， 9，12， 13， 15 B组: 2， 3， 5， 7， 10， 11 C组：4， 6， 8， 14 按原随机数字顺序继续抄一随机号: 08 除以6 余数: 2, 将8组第二只，即3号小鼠编入C组。 调整后各组的编号 : A 组：1， 9，12，13， 15 B 组：2， 5，7， 10， 11 C 组: 3，4， 6， 8， 14,练习： 20个小鼠，根据下例随机数顺序，将其随机分成4组。 取P.187,表221，第1行 随机号：22 17 68 65 84 68 95 23 92 35 87 02 22 57 51 61 09

3、43 95 06 58 24 82 03 47,鼠号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机号： 22 17 68 65 84 68 95 23 92 35 除以4余数：2 1 0 1 0 0 3 3 0 3 鼠号： 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 随机号： 87 02 22 57 51 61 09 43 95 06 除以4余数：3 2 2 1 3 1 1 3 3 2 随机号： 58 24 82 03 47,根据余数分组鼠号： A组： 2 4 14 16 17 B组： 1 12 13 20 C组： 7 8 10 11 15 18 19 D组： 3 5 6

4、9 继续按顺序抄2个随机号： 58 24 58/ 7 余数为2，即C组第2个动物（8号）编入B组。 24/6 余数为0，即C组余下的6个动物中的第6个（19号）编入D组。,调整后随机分组的结果为（按动物号）： A组： 2 4 14 16 17 B组： 1 8 12 13 20 C组： 7 10 11 15 18 D组： 3 5 6 9 19,按随几号大小顺序分组法将20只小鼠随机分成4组(取P.187,表221，第1行) 鼠号： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机号： 22 17 68 65 84 68 95 23 92 35 鼠号： 11 12 13 14 15 16 17 18

5、 19 20 随机号： 87 02 22 57 51 61 09 43 95 06 鼠号： 12 20 17 2 1 13 8 10 18 15 随机号： 02 06 09 17 22 22 23 35 43 51 鼠号： 14 16 4 3 6 5 11 9 7 19 随机号： 57 61 65 68 68 84 87 92 95 95,分层随机,先将需严格控制的主要因素，如性别、体重等分为不同类别，或层次；在每一类别或层次中分别随机分成一定组。 将每一类别或层次随机分成的组,组次相同的分别合并。,3. 重复 ： 目的：验证在类似的条件是否可获得结果的重现以及结果的变异情况 。 要点： A.

6、确定适当的样本数。 B.各组动物数目尽量相同。 按动物类型确定样本数： （1）小动物：计量10例;计数30例 （2）中等动物：计量 8 ;计数 20例 （3）大动物5-8例,第四节 中药药理实验设计的注意事项,一、实验动物 1、按要求选择不同级别符合医学实验标准的动物 一级：普通动物（亦称常规动物或无疾病的动物）； 二级：清洁动物（饲养在温度恒定，普通设施中的动物，饲料、垫料，用具均经过高压消毒）；,三级：无特殊病原体动物（specific-pathogen free , 简称SPF动物）；在清洁级基础上还需不带干扰实验的微生物，在隔离室或层流室饲养 。 四级：无菌动物（机体内外均无任何寄生虫

7、的动物，一般是临产前按无菌手术 剖腹取出胎仔，在无菌条件下用无菌饲料繁养获得的动物）。,2、根据实验目的选择敏感种系 心血管系统: 大鼠猫、犬、小型猪等。 体温调节：兔 呕吐实验：鸽、猫或狗等。 免疫调节：纯种小鼠 原则:选择对药物的反应与人体相近的 种系。,3、性别 ：根据要求选择 用一种性别比两种性别兼用所得结果离散度较小。 4、年龄体重 ： 每批动物的体重，年龄越接近越好 通常：小鼠:18-22g，大鼠:20025g， 豚鼠:250-300g，兔、猫:1.5-2Kg, 犬:10-15kg。 大鼠、小鼠:6-8周龄,4、数量 ： 计量研究：小鼠每组10只 大鼠每组8只 豚鼠或兔每组6只 猪

8、或狗5只 计数研究：小鼠每组30只 大鼠每组20只,5.习性: 小鼠、大鼠均为群居动物，不宜单独饲养。,二、 受试药,1.制备情况： （1）新药受试药要求：用处方固定，质量稳定、工艺、质控指标恒定后的中试产品。 （2）一般受试中药：生药经鉴定，科属种清楚；提取制备工艺明确，含量确。 （3）中药单体：化学结构式清楚。 （4） 动物给药量：以g/kg或mg/kg生药量或有效组分含量表示。,2、给药途径,实验的给药途径与临床拟使用的途径一致。 中药粗制剂一般不用注射给药或体外实验的方法检测药物效应 。,3、给药时间,注明首次给药时间及每次给药的间隔时间。 预防性给药： 治疗给药：,4、剂量：,剂量组

9、数：新药研究至少设3个剂量组。 三者最好成等比，能反应量效关系。 给药容量相等，浓度不等。 合理选择剂量： （1）参考LD50：在LD50的1/10、1/20、1/40等范围内设置高、中、低剂量组。 （2）根据临床用药等效量计算 ：,不同种类动物等效用药量的计算,应用举例： 某复方的总药量是60g/剂，每天1剂。按实验动物与人用药量折算表计算 ，200g重大鼠等效量是多少？（按 g/kg计算）。 200g重大鼠等效量为：60g0.018 =1.08g/只， 或： 60g561.07g/只 大鼠每公斤的给药量是：1.08g1000/200=5.4g/Kg,人的每公斤体重给药量为：60g70=0.

10、857g/Kg。 按体重计算，要达到等效，大鼠的剂量应为人用剂量的5.4g/Kg0.857g/Kg=6.3（倍）。,如同一复方要用小鼠实验，小鼠每只的给药量为： 600.00260.156g/只； 0.1561000/20=7.8 g/Kg； 按体重计算，要达到等效，小鼠的剂量应为人用剂量的7.80g/Kg0.857g/Kg=9.1（倍）。,豚鼠应用量为6031.5=1.90g/只； 1.901000/400=4.762g/Kg。 按体重计算，要达到等效，豚鼠的剂量为人用量的 4.7620.8575.56（倍）。,兔：6014.24.225g/只； 4.2251.52.81 6g/Kg。 按体

11、重计算，要达到等效， 兔的剂量应为人用量的 2.8160.8573.287（倍）。,狗用量为60g3.119.35g/只； 19.3512=1.61g/Kg。 按体重计算，要达到等效， 狗的给药量应为人的 1.610.8571.88（倍）,根据不同种类动物等效用药量表 练习：,某利尿 中药对250g重大鼠的有效量为240 mg/kg，试计算12kg犬的等效实验剂量？（按 mg/kg计算）,答案： 240 mg/kg4 = 60 mg/只 60 mg/只17.8 =1068 mg/只 1068 mg/只12 = 89 mg/kg,噻嗪类,不同种类动物间用药剂量换算表（转换因子 计算法）,某利尿

12、中药250g重大鼠的有效量为250 mg/kg，试计算15kg犬的等效实验剂量？ 犬的等效实验剂量 250 mg/kg6.922 =78.4mg/kg,不同种类动物间用药剂量换算表（体表面积/kg体重 比值法）,某利尿 中药250g重大鼠的有效量为250 mg/kg，试计算15kg犬的等效实验剂量？ 犬的等效实验剂量 250 mg/kg0.160.47 =85.1mg/kg,按体型分数换算法,采用下列公式：,式中dB是欲求算的B种动物（包括人）的kg体重剂量，dA是已知A种动物（包括人）的kg体重剂量；WA、WB是已知动物A、B的体重；RA、RB是动物的体型系数,动物与人的体型系数,例：已知家

13、兔2kg，用药50mg/kg，求算家犬5kg体重的用药量。 dA=50， RA=0.093 ， RB=0.104， WA=2，WB=5，代入上述公式：,（3）根据文献估计剂量 如有相关的药物，相似的复方，其使用剂量可作为参考。 （4）通过预试估计剂量,5给药容量： 小鼠口服： 0.1ml-0.25ml/10g 最大不超过0.4ml/10g 其他途径不超过0.25ml/10g。 大鼠口服：10ml/kg, 不超过2.0ml/100g 其他途径不超过1.0ml/100g.,药物溶液配置,例：戊巴比妥钠对小鼠腹腔注射的有效麻醉剂量为40mg/kg。现有体重为20g左右的30只小鼠要麻醉。试问要称量多

14、少克的戊巴比妥钠，设计的给药容量为多少，配成怎样浓度 ？,药物溶液配置,答： 20g左右的30只小鼠总体重600g. 40mg/kgx0.6kg=24mg 24mg4mg/ml=6ml 称量戊巴比妥钠30mg，加生理盐水至7.5ml, 使浓度为4mg/ml, 小鼠腹腔注射0.1ml/10g(即10ml/kg)。,三、 对照药,合法性：中国药典收载或符合部颁标准，或新批准合法生产的药物。 可比性：其功用、主治、剂型（给药途径）与受试药相似。特殊情况下，在合理范围内可适当灵活掌握。 择优选用：有多种同类药可供选用时，应择优选用公认疗效较好的药物。,选择的阳性对照药要注意有无批准文号。 如：麝香保心

15、丸：国药准字Z31020068 生产单位： 有效期：必须用有效期内产品。 恬尔心注射用：国药准字（2001）J53号：进口药品注册证号：BX20010122）,四、 实验条件控制,时辰：动物生理活动有其昼夜节律，如小鼠夜间活动增加，白天活动减少。最好每批实验在每天相同的时间测定。 环境温度：室温稳定、适宜。 饮食：有些实验需对动物禁食。 预适应：37天。,五、 数据表达和常用统计分析的注意事项,(一)数据表达 和精确度： 一般应至少有3位有效数字， 标准差至少有2位有效数字， 均数的小数位数应与标准差相同， 出示的结果应包括均数，标准差，例数，P值情况（0.05,或具体P值） 数字的精确度要与

16、测量仪器所能达到的精确度一致。,表5 增液汤、四逆汤对腹主动脉不完全结扎致心室重构大鼠动脉血压的影响,与模型组相比, * P0.05; * P0.01,(二)极端数据（outliers）的处理 ： 避免差错形成极端数据。 对可疑数据及时复测或复核,及时纠正差错。 在x3s 之外数据，可考虑舍弃。否则不应随便舍弃 -根据新药（西药）临床药研究指导原则汇编（药学、药理学毒理学）,一组数据按正态分布时： x s 内的数据占68.27% x1.96s 内的数据占95.0% x2.58s 内的数据占99.0%,(三)数据统计分析应避免的差错： 1.量反应资料： (1) 两组间实验结果比较常用t检验 （u

17、npaired t test）。,df=n1 + n2 - 2,T值计算公式（通式）,下列情况两组间比较不能使用t检验: 方差不齐改用校正t值法（即t检验）。 方差齐性检验： 如两组的标准差相差一倍以上时，基本可判断为方差不齐。,通过计算，当 FF0.05 时可判断为方差不齐。 F = s12 / s22 F0.05=1.2+(8/ n1)+14/(n2 -3) (式中S较大者为S1、n1，较小者为S2, n2)。 F0.05也可通过可查“方差齐性检验F值表”获得（注：与“方差检验F值表”不同）。,如：有两组数据,需统计有无显著差异： 甲组：11.5，14.1，12.3, 10.8，13.0,

18、 13.2, 13.9 12.3, 10.6 乙组：10.0, 11.9, 12.0, 12.8, 14.9, 17.4, 19.3, 20.2, 23.1 计算 x1s1： 12.411.26(n=9) x2s2: 15.734.48(n=9) 查无应舍数据。 有无方差不齐：F=4.482 / 1.262=12.64 F0.051.2+8/9+14/(9-3)=4.422 FF0.05 说明两组方差不齐，用t检验。,方差不齐时的校正t值 计算公式,甲组：11.521.26(n=9) 乙组：15.734.48(n=9) 按上式计算 t=2.142,相应自由度界值近似值的计算公式如下：,t,上式

19、中t1为自由度为n1-1时的界值； t2为自由度为n2-1时的界值。 当t当前的绝对值大于或等于上述界值时，P,t0.05,本例自由度 (n1-1)及(n2-1)均为（91）8; 查表得t0.05的界值为2.306，代入公式计算得 t0.05。 两组间比较无显著性差异。,2.306,甲组：11.521.26(n=9) 乙组：15.734.48(n=9) 按上式计算 t=2.142,但以“t”检验，上述两组数据f=9+9-2=16 f=16 时 t0.05=2.120 ， 将得出:P0.05, 两组数据有显著差异的错误结论。,EXCEL软件T检验过程： 选中fx T TEST显示填写框：,Arr

20、ay 1 A1:A9 Array 2 B1:B9 Tails 2 Type Array1 为第一个数据集。 Array2 为第二个数据集。 Tails 指示分布曲线的尾数。 如果 tails = 1，函数 TTEST 使用单尾分布。如果 tails = 2，函数 TTEST 使用双尾分布。,Type 为 t 检验的类型。 1：成对检验 2：等方差双样本检验 3：异方差双样本检验 上列 Type填“2”时 p=0.045993 Type填“3”时 p=0.57358,数据明显偏态时,不能用“t”检验，不用xs表达。 （改用中位数检验，用非参数统计法。如Mann-Whitney秩和检验，等级和检验

21、，序值法等）。 偏态简便判断法A：如均数两侧例数之差大于2n时不用检验，即可判断为明显偏态。,例 1：,一组数据是否正态分布： 15.1, 17.9 , 18.2 , 14.3 , 16.5 , 19.7 , 18.6 , 17.4 , 18.1, 40.8, 38.9 分析： xs21.419.26， n=11, 均数左边9位、右边2位，均数两侧例数之差为7， 211=6.63, 上述一组数值为偏态，不可用正态检验。,偏态简便判断法B: 用公式R4 n D2 ， D为均数两侧例数之差，n为例数， 如R为负，表示数据肯定为偏态。 如上述一组数据: R411 - 77= -5, 表示数据肯定为偏

22、态。,例2： 一组数据总数为50例，大于均数35例，小于均差15例，是否为正态分布？ R450（3515）2 200400200， 此组数据为偏态。 如有不定值（如30，10等）不用t检验，改为中位数表达，用非参数统计法。如Mann-Whitney秩和检验，等级和检验，序值法等。,(2) 配对资料t检验：（paired t test）,适用情况： 同一批受试对象试验前后的配对数据。 同一批受试对象身体两个部位试验测得的数据。 同一批受试对象用两种检验方法的测试的结果。 检验方法：t= s ,如某次对中药提取物的降压实验结果如下，是否降压？（1pKa=7.5006mmHg）： 用药前: 12.0

23、, 14.0, 13.0, 18.0, 16.0, 15.0, 15.0, 19.0 15.32.4 (n=8) 用药后: 10.0, 11.0, 13.0, 16.0, 13.0, 14.0, 13.0, 17.0 13.42.3 (n=8) 两组直接进行组间比较，两者间并无显著差异。,用药前: 12.0, 14.0, 13.0, 18.0, 16.0, 15.0, 15.0, 19.0 用药后: 10.0, 11.0, 13.0, 16.0, 13.0, 14.0, 13.0, 17.0 差值： 2.0, 3.0, 0 2.0, 3.0, 1.0 2.0, 2.0, xs 1.870.99

24、 (n=8) 配对t检验 ： t=（1.87/0.99） 8=5.357 p0.01 （F=7时， t0.05=2.565 t0.01=3.499),但进行配对t检验时，要确信除待分析的因素外，其他可控条件一致。否则可分别取配对变化值或变化率;求均数及标准差。同时设对照组，同样处理后，再进行两组间的t检验，这样更能提高检验效率。,例：某药给药2周前后血压变化如下，问该药有无降压作用？ 组1 大鼠血压 （xs mmHg) 给药前180 165 190 200 192 158 175 185 178 给药后150 140 170 160 159 130 145 153 155 变化 30 25 2

25、0 40 33 28 30 32 23 计算：xs 29.05.93 t=（29.0/5.93）3=14.67 f=9-1=8, t0.01=3.355 p 0.01,在本例自身对照（自身前后配对）实验时，同一个体在经历一段时间后（如2周），即使不作任何处理（给药），所得指标也可能有变化，为鉴别该组血压变化是否为非药物因素引起，实验时宜设立一个平行对照组进行比较。这样就有实验组观察前后和对照组观察前后4组数据。可分别求出给药组和对照组的变化值（差值）或变化率及标准差，再进行两组间的t检验。如：,组2大鼠血压（给对照液组）（xsmmHg) 前 175 165 195 205 150 145 18

26、0 171 176 后 160 155 185 190 145 145 171 162 165 变化 15 10 10 15 5 0 9 9 11 9.34.7 配对t检验：t=（9.3/4.7）3=5.936； f=9-1=8, t0.01=3.355 P0.01,两组原始值间比较 ： 给药前：给药组： 180.313.3(n=9) 对照组：173.619.2(n=9) t=0.860 p0.05 两周后：给药组： 151.311.9 对照组： 164.215.8 t=1.957 p0.05,两组差值组间比较： 组1： 给药前后差值： 29.16.0 组2：给对照液前后差值：9.34.7 t

27、=7.794 f=16, t0.05=2.120 t0.01=2.921 p0.01,(3)方差分析（analysis of variance, ANOVA),有时用某药的不同剂量与同一对照组比较，并同时要分析不同剂量作用有无区别时，构成了多组均数的组间比较，此时常使用单因素方差分析。 使用方差分析时，仍然要首先考虑各组样本是否符合正态分布，方差是否齐性，若符合，方可进行分析。计算F值，分析总体是否有差异。,方差分析,F=组间方差/组内方差 F 1时说明组间随机误差与组内随机误差接近，研究因素的作用不明显。 F1, 说明组间变异组内变异。方差分析即计算F值，并根据自由度，判断组间变异即研究因素

28、引起的可能性有多大（确定P值）。 如p0.05,再进行组间两两比较。,使用方差分析的条件： 各组样本是相互独立的随机样本； 各样本符合正态分布； 各处理组总体方差齐性。 若符合正态分布，方差齐性，则进行综合比较，当F0.05时，说明综合比较有显著差异，再进行组间两两比较。,组间多重两两比较,常用LSD (least significant difference) t检验，或q检验 (student-newman-keuls test)。 如一次实验多个组中有一个共同的对照组，所关心的是各实验组与对照组间的比较，而各实验组间并不需要相互比较时，宜选用Dunnett检验（Dunnetts test

29、）,SPSS软件具有Homogeneity of variances程序，可预先对多组间比较进行方差齐性检验。 方差齐时采用LSD , q 或Dunnett检验法进行两组间比较。,若方差不齐时可考虑作如下处理： （1）通过数据转换可成正态分布时，先进行数据转换（如取对数）后再进行方差分析； （2）采用非参数检验，如秩和检验、序值法等 。,计量资料统计方法的选择,2. 质反应资料,又称计数资料。有时机体对药物的反应只有“是”或“否”两种，如用药后动物死与不死。翻正反射的存在或消失，某种病理症状（如惊厥）出现或不出现等，实验结果可以是百分比或自然比，其显著性检验一般采用卡方检验（22法）。,X2=

30、 有效 无效 总计 有效率 甲药 35 (a) 15(b) 50(a+b) 70% 乙药 25（ C) 25(d) 50(c+d) 50% 总计 60(A+c) 40(b+d) 100(n),四格表的自由度恒等于1。 0.05的机率点界值为3.841 。 X20.05, 两药作用无显著性差异。,样本较小（两组总数40例）或数据中有0或1时：不用卡方检验，而用精确概率法或简化直接概率法。 例：使用甲药16例中5例出现不良反应，使用乙药16例无不良反应，两药有无区别？,p= p= 16!16! 5!27! /5!0!11!16!32! =0.0217 注：上式为单侧概率值，当a+b=c+d时，四格表内各种组合呈对称分布，单侧检验p值乘以2