第二章 荧光和化学发光分析法.ppt

1、,第二章 荧光和化学发光分析法,09:21:13,09:21:13,Stokes 用分光计观察到： 荧光的波长比入射光的波长稍微长些,五颜六色雨后路面上水珠油膜呈现,09:21:13,基态分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时，以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量。,分子发光：,分子,+,电能,化学能,光能,生物活性参 与化学发光,电致发光,化学发光,光致发光,生物发光,荧光,磷光,09:21:13,分子发光：,光致发光：,光,09:21:13,2.1 荧光分析法,2.1.1 荧光分析法基本概念,2.1.2 荧光强度及影响因素,2.1.3

2、仪器装置,2.1.4 定量分析方法,2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用,09:21:13,A 分子的激发态分子激发态和三线激发态,激发态： 基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到高能级的分子轨道上称为电子激发态 。是分子的亚稳定状态。,基态： 在正常状态下，分子处于最低能级的分子轨道上称为基态。是分子的稳定状态。,2.1.1 荧光分析法基本概念,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,电子自旋多重度,电子从基态跃迁到激发态，分子中的电子可以处在不同的自旋状态,常用电子自旋多重度来描述。,M = 2S + 1,S是电子的总自旋量子数，各电子自旋量子数的代数和。,2.1.1.1 荧光及其

3、产生,09:21:13,单重态（M=1）：电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。,三重态（M=3）：分子中的电子对的电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。,S2 T2 S1 T1 S0,(洪特规则),M = 2S + 1 M自旋多重度 S总自旋量子数,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,2020/8/8,S2,S1,S0,T1,吸 收,发 射 荧 光,发 射 磷 光,系间跨越,内转换,振动弛豫,能 量,l 2,l 1,l 3,外转换,l 2,T2,内转换,振动弛豫,分子荧光和磷光发射过程,09:21:13,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁

4、(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能量。,返回速度快的途径，发生几率大!,B 分子去激发过程及荧光的产生,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,e,（1）. 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动时间10 -11 10 -13 s。,1、非辐射跃迁,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,e,（2）. 内转换：相同多重度的电子能级中, 相等能级间的非辐射能级交换。发生内转换的时间10-12 s。,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,e,（3）. 系间跨越：不同多重态在有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。电子自旋改变，跃

5、迁禁阻，通过自旋-轨道耦合等跃迁。,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,（4）. 外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射跃迁。 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,（1）. 荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态各振动能级，发射时间约为10-710-9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长。,e,2、辐射跃迁,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,（2）. 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态各振动能级。发光时间：10-410s 。,e,S0 激发态振动

6、弛豫内转换系间跨越振动弛豫 T1 S0,2.1.1.1 荧光及其产生,09:21:13,1、荧光激发光谱,固定荧光测量波长，改变激发光的波长，测量不同波长ex激发光照射下荧光强度的变化，记录荧光强度F与激发光波长的关系曲线。,2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,09:21:13,2、荧光发射光谱,固定激发光波长和强度，记录在不同波长em下所发射的荧光强度所得关系曲线即不同波长下荧光强度的分布。,发射光谱的形状与激发波长无关。,2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,09:21:13,荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系,2.1.1.2 荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,吸收光谱的

7、形状表明了分子第一激发单重态的振动能级；发射光谱表明分子基态的振动能级结构。 基态与激发态两者的振动能级结构相似，激发与去激发组成相反的两个过程。,09:21:13,分子产生荧光必须具备的条件,1. 具有合适的结构：通常是含有苯环和稠环的刚性结构的有机分子； 2. 具有一定的荧光量子产率。,2.1.1.3 荧光效率,09:21:13,=,发射荧光的分子数,激发分子总数,2.1.1.3 荧光效率,荧光量子产率（）： 衡量荧光物质发光能力。 它表示激发分子发射出荧光(或磷光) 的比例。,09:21:13,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，可用各过程的速率常数来表示荧光量子产率：,荧

8、光发射过程的速率常数，取决于分子结构。,各种非辐射跃迁过程的速率常数之和。取决于分子所处的化学环境，同时也与化学结构有关。,2.1.1.3 荧光效率,09:21:13,荧光分子与其他分子相互作用引起荧光强度降低甚至荧光消失的现象为荧光猝灭，又称荧光熄灭。,（1）、 碰撞猝灭-动态猝灭,M* + Q M + Q + 热量,激发态分子,猝灭剂,2.1.1.4 猝灭,09:21:13,（2）、 生成化合物的猝灭-静态猝灭,M + Q M Q,基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。,2.1.1.4 猝灭,（3）、 能量转移,M* + Q M + Q*,激发态的分子与猝灭剂作用，

9、能量发生转移，猝灭剂被激发。,09:21:13,（5）、 自猝灭,荧光物质的浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引起能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。,2.1.1.4 猝灭,（4）、 氧的猝灭,氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，可能包含着多种机理。,09:21:13,2.1.2 荧光强度及影响因素,2.1.2.1 荧光强度与溶液浓度的关系 2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系 2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光 2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响,09:21:13,Epsilon（大写，小写），是第五个希腊字母。 汉字读音：艾普西龙,朗伯-比尔定律,P15,09:

10、21:13,A 跃迁的类型,n * max100 平均寿命10-510-7 s； * max104 平均寿命10-710-8 s,* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型，具有* 共轭双键的分子才能发射较强的荧光。,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,荧光的产生是分子先经历* 或n * 激发，然后经振动弛豫或其他非辐射跃迁再发生* 或* n 而得到荧光。,09:21:13,B 共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动。,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,0.11,0.28,0.36,0.52,278,321,404,480

11、,09:21:13,C 分子共平面效应,芴, = 1,联苯, = 0.2,荧光分子的共平面性增加，则共轭体系大，有利于* 跃迁。,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,09:21:13,荧光黄, = 0.92,酚酞, = 0,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,09:21:13,D 取代基效应,1. 给电子取代基加强荧光,-NH2，-NHR ，-NR2，-OH， -OR ，-CN,产生 p 共轭,2. 吸电子取代基减弱荧光,-C=O， -COOH ，-NO2,摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，同样使荧光减弱。,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,09:21:13,

12、D 取代基效应,2.1.2.2 有机物的荧光与其结构的关系,A 跃迁的类型,B 共轭效应,C 分子共平面效应,09:21:13,2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光,（2）螯合物中金属离子的发光,（1）螯合物中配位体的发光,09:21:13,2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光,（1）螯合物中配位体的发光,不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。 如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。,09:21:13,2.1.2.3 金属离子螯合物的荧光

13、,这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd 跃迁和ff跃迁，最终发射的是dd跃迁和ff跃迁光谱。,（2）螯合物中金属离子的发光,09:21:13,2、溶剂,3、溶液黏度和温度,4、溶液的PH值,2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响,1、激发光源,09:21:13,2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响,1、激发光源,激发光强度I0大，荧光强度增大，灵敏度增高。,2、溶剂,主要表现为溶剂的极性、氢键、配位键的形成对化合物的荧光发生变化。 *跃迁类型：溶剂极性增大，跃迁能量降低，发生红移，荧光增强。 氢键、配位键的形成主要影响荧光分子的存在型体

14、、电离状态，荧光强度和形状均发生很大变化。,09:21:13,3、溶液黏度和温度,黏度大，温度低，可减小碰撞引起的荧光熄灭，荧光强度增大。 温度升高，外转换的几率增加，荧光强度降低。,4、溶液的PH值,不同PH值下，荧光分子存在形式不同。,2.1.2.4 实验条件对荧光强度的影响,09:21:13,2.1.3 仪器装置,Cary Eclipse 荧光分光光度计 荧光、磷光化学/生物发光 美国瓦里安技术中国有限公司,09:21:13,一、荧光分光光度计结构流程,2.1.3 仪器装置,组成：激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。 特殊点：两个单色器，光源与检测器通常成直角。,09:21:1

15、3,1、激发光源,汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。,2、样品池,I0,It,If,样品池四面透光。,2.1.3 仪器装置,09:21:13,4、检测器,一般采用硒光电池。 检测器的方向与激发光的方向成直角，以消除样品池中透射光和杂散光的干扰。,3、单色器,激发单色器： 选择激发光波长，用以分离出所需用的激发光。 发射单色器： 选择荧光发射波长，用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射的荧光。,2.1.3 仪器装置,09:21:13,二、磷光分光光度计结构流程,利用荧光和磷光发射寿命的差别,通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。,09:21:13,2、定量方法,1、定量

16、依据,2.1.4 定量分析方法,09:21:13,1、定量依据,荧光强度 If 正比于吸收的光强度 Ia 和荧光量子产率 ：,由朗伯-比耳定律得：,荧光强度 If ：,2.1.4 定量分析方法,09:21:13,对于稀溶液，当 2.303bC 0.05时：,If -荧光强度 I0 -入射光强度 f -荧光量子产率 b - 吸收光程 - 摩尔吸光系数 C - 物质浓度,2.1.4 定量分析方法,09:21:13,2、定量方法,标准曲线法：,2.1.4 定量分析方法,09:21:13,A 无机化合物的荧光分析 如Mg、Al、Ca等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定； 直接法

17、：如8-羟基喹啉与Al离子反应生成荧光配合物 安息香，水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇， 二苯乙醇酮,2.1.5 荧光分析测定方法、特点和应用,09:21:13,荧光熄灭法,09:21:13,B 有机化合物的荧光分析 本身发射荧光的，如罗丹明B、荧光素等可直接测定； 不发射荧光的物质可经过处理后成为发射荧光的物质进行测定；,09:21:13,C：蛋白质的荧光分析 蛋白质的基本结构，有的氨基酸自身可以发荧光，例如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸,09:21:13,2.荧光胺和氨基反应生成 具有荧光的产物,3.邻苯二甲醛（OPA）在一定 的条件下可与伯胺、多胺生成 具有荧光的产物,09:21:13,D 核酸检

18、测生命物质 常选用一些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究脱氧核糖酸(DNA)与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。,化合物对DNA的安全性,电泳后,点样处,pUC19 (2686bp) 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，buffer: 50mM Tris-HCl/50mM NaCl (Ph 7.4) ，化合物2.0uM浓度下的损伤测试 （37 1h） a: DNA空白对照 b:巯基乙胺(12.0uM)+DNA c:DNA+2.0uM化合物 d:巯基乙胺+DNA+2.0uM化合物,09:21:13,分子磷光分析法,特点 发光速率慢 寿命比荧光长10-410s 辐射的波长比荧光的长