内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊bmp2部分基因片段的克隆及分析.docx

内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊 BMP2 部 分基因片段的克隆及分析 (内蒙古化工职业学院，内蒙古 呼和浩特 010010) 摘 要：从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组 DNA，根据已报道的 BMP2 基因的保守序列设计上下游引物， 扩增山羊及蒙古绵羊的 BMP2 基因部分序列，将此片段克隆 到 pMD18-T 载体中，筛选阳性克隆，提取质粒 DNA，并进行 序列测定，并将两者序列进行比对。结果山羊该核苷酸片 段与蒙古绵羊的同源性达 99%，另与 GenBank 中人、小鼠、 牛、绵羊的同源性分别为 87%，85%，98%和 99%。说明该基 因在不同物种间具有较高的保守性，尤其是山羊与绵羊之 间具有更高的保守性。 关键词：骨形态发生蛋白；基因克隆；序列分析 中图分类号：S827S826.82 文献标识码：A 文章 编号：10076921(XX)06006403 绒山羊的皮肤和毛囊结构特征不仅是其生物学特征的 重要内容，而且对其主要产品绒毛产量和品质产生直接 的重要影响。关于绒山羊绒毛生长机理的研究热点，尹俊、 李长青、张燕军等在绒山羊的毛囊发育、生长周期及皮肤 基因的表达作了大量的研究17。BMP,即骨形态发生 蛋白,是 1965 年 Urist8 对脱钙骨基质的成骨研究中 发现的。BMP 是一组能在骨骼外异位诱导软骨和骨形成的分 泌型蛋白质,其组成不少于 20 种9 。通过研究发现, BMP 家族决定家畜不同时期的生长发育,骨骼形成,并且是毛 囊发育涉及的信号分子之一。毛囊形态发生的起始信号源 于真皮10 ，真皮细胞和上皮细胞之间相互作用，导 致两个细胞群体的有序增殖和分化，并最终形成完整的毛 囊11 。最近已报道 BMP2 与小鼠次级毛囊的发生有关。 关于绒山羊和蒙古羊毛囊发育与 BMP2 的关系还未见报道。 本实验克隆绒山羊与蒙古羊 BMP2 基因片段，目的在于研究 BMP2 基因在绒山羊和绵羊毛囊发育过程中的表达情况，为 进一步阐明绒毛生长的机理奠定基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 阿尔巴斯绒山羊血液采自内蒙古阿白羊场，蒙古绵羊 血液采自侯先志教授实验牧场。基因组 DNA 提取试剂盒、 质粒小提试剂盒、载体 pMD18-T、Ex taq DNA 聚合酶、 IPTG、X-gal、氨苄青霉素、Lambder DNA/EcoRI+HindIII、DL100 均购于 TakaRa 公司。其他试剂 皆为国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组 DNA 的提取方法。按照 TakaRa 公司血液 基因组 DNA 提取试剂盒说明书基因组 DNA ，灭菌三蒸水溶 解，-20保存。 1.2.2 PCR 引物的设计与合成。根据人、鼠、绵羊、牛 的 BMP2 基因的保守序列，设计引物，由大连宝生物基因技 术公司合成，引物序列如下： F ：5 AAT AGC AGT TTC CAT CAC CGA ATT 3 R ：5 GAG GCG TTT CCG CTG TTT GT3 1.2.3 PCR 扩增条件。PCR 反应的总体积为 20l，含 1.5mMol/LMg2，10buffer，50ng 模板 DNA，dNTP 的终 浓度为 75Mol/L，引物终浓度为 0.4Mol/L，2.5TaqDNA 聚合酶。PCR 扩增条件：94 5min，94 1min，55 1min ，72 1.5min，循环 30 次， 最后 72延伸 5min。PCR 产物用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检 测。 1.2.4 PCR 产物的克隆。将 PCR 产物连接到 pMD18-T 载 体，转化已制备好的 E.coli DH5 感受态细胞，涂布于含 氨苄青霉素、IPTG、X-gal 的 LB 培养基平版上，37温箱 培养 1620h。 1.2.5 阳性克隆的筛选和鉴定。挑取白色单菌落于 10ml 含氨苄青霉素的 LB 培养液中，37,150rpm/min，振 荡过夜。取 20l 菌液快速筛选阳性克隆12，1.5%琼 脂糖凝胶电泳检测。筛选滞后条带作为重组子，按质粒提 取试剂盒操作说明提取质粒 DNA，PCR 鉴定，条件同上。 1.2.6 序列测定与分析。 将两个阳性克隆的菌液寄到上海生工生物工程公司进 行测序。将获得 DNA 序列与 GenBank 数据库中公布的已知 功能基因进行序列同源性比较以鉴定和获得该 DNA 序列的 功能信息。 2 结果 2.1 阿尔巴斯绒山羊基因组 DNA 及 BMP2 基因部分外显 子的扩增 基因组 DNA 在 1.2%的琼脂糖胶中电泳，条带清晰,没有 拖尾。经分光光度计测 OD260/280 的值在 1.61.8 之间。 利用人和鼠 BMP2 基因同源序列设计上下游引物，设计 梯度 PCR 从山羊基因组中扩增出了一条特异条带，测序结 果为 387bp 与预期大小一致。 2.2 PCR 扩增产物与 T 载体连接及其鉴定 PCR 扩增产物连到 pMD18-T 载体上，经转化，利用重组 子快速鉴定，筛选滞后重组子并提取质粒 DNA，经 PCR 鉴定 结果，得到目的片段，与预期结果一致。 740)this.width=740“ border=undefined 740)this.width=740“ border=undefined 2.3 测序及序列分析 2.3.1 阿尔巴斯绒山羊测序结果及序列分析。将筛选 的阳性克隆进行测序,序列与 GenBank 数据库进行序列同源 性比较，结果表明获得了绒山羊和蒙古羊 BMP2 基因基因片 段。 2.3.2 绒山羊和绵羊 BMP2 扩增片段的分析。绒山羊 BMP2 与绵羊 BMP2 扩赠序列之间的比较,二者同源性达到 99%， 只有三个碱基不同(图 4)。山羊该核苷酸片段与人 BMP2 同 源区段的同源性 87%，与小鼠的同源性 85%，与牛的同源性 98%。 740)this.width=740“ border=undefined 2.3.3 绒山羊 BMP2 部分序列所编码蛋白质与绵羊及牛 的比较。绒山羊、蒙古羊 BMP2 扩赠序列推导的氨基酸序列 只有 2 个不同(图 5),绒山羊和牛 BMP2 同源区段之间有 4 个 氨基酸不同, 蒙古羊和牛 BMP2 同源区段之间有 3 个氨基酸 不同。 740)this.width=740“ border=undefined 3 讨论 由于 BMP2 是骨形态发生蛋白成员之一，属于 TGF-1 超家族成员，属于相关信号通路信号分子，上皮-间充质间 相互作用的一系列信号分子、信号通路及信号分子间相互 作用实现了毛乳头细胞诱导、控制和调节毛囊的形态发生 及维持毛囊的生长发育、周期性循环的作用。BMP2 不仅具 有促进软骨和骨组织形成的作用，而且证实对骨组织，脑 组织，和脊髓组织的生长，发育，分化有重要的调节作用， 并参与细胞凋亡和细胞信号转导的调节。本实验对羊骨形 态发生蛋白 2 基因的部分外显子序列克隆，测序结果表明， 此基因在不同物种之间具有较高的保守性，这对羊 BMP2 基 因功能，调控研究有重要的意义，也为下一步羊 BMP2 全长 基因的克隆、表达、以及基因功能研究奠定基础。国外在 人和鼠毛囊发育、生长周期性变化的组织学形态方面作了 深入的观察，在描绘控制人和鼠毛囊发育和周期的分子机 制上已取得了较大的进展，毛囊在发育不同阶段和出生后 不同周期之间的转化为毛囊角质化细胞和毛乳头成纤维细 胞之间的双向信号交换所控制，似乎有很多生长刺激子和 抑制子涉及调节控制毛囊发育和出生后周期活性13。 因此，如何利用目前国外研究的毛囊的组织学和涉及控制 毛囊发育和生长的分子信号途径的成果，将其应用于绒山 羊的研究，用来改良绒山羊的生产性能和绒的品质是当前 我们绒山羊育种的中心，也是今后绒山羊研究的主要方向 之一。 参考文献 1 尹俊，李金泉，张燕军.内蒙古成年绒山羊皮肤 基因表达的研究J.畜牧兽医学报，XX,36(10), 9961000. 2 尹俊，李金泉,郭志成.内蒙古绒山羊 105 天胚 胎皮肤中的基因表达J.畜牧兽医学报，XX,36(11), 11211124. 3 尹俊，扈廷茂，李金泉.内蒙古蒙古绒山羊 6 个 与相似绵羊 KAP6-1 的 cDNAs 的克隆及特征分析J.遗传 学报，XX，31(5):502507. 4 尹俊，扈廷茂，李金泉.内蒙古绒山羊毛囊兴盛 期皮肤 cDNA 文库的构建及 KAP6-2 cDNA 的克隆J.动物 学研究，XX,25：166171. 5 李长青，尹俊，张燕军.内蒙古绒山羊与辽宁绒 山羊皮肤毛囊周期性变化的比较研究J.畜牧兽医学报， XX，36：674679. 6 尹俊，李金泉.绒山羊两个 HGT KAP8 cDNAs 的 特征分析A.第十三次全国动物遗传育种学术讨论会论 文集C，*：畜牧兽医学会动物遗传育种分会， XX：165168. 7 张燕军，尹俊，李长青.内蒙古白绒山羊胎儿期 皮肤毛囊发育的组织学研究A.第十三次全国动物遗传 育种学术讨论会论文集C.*：畜牧兽医学会动物遗传 育种分会，XX：610614. 8 Urist MR. Bone formation by autoinductionJ.science,1965.150:893-899. 9 Hino J ，Takao M，Takeshita N，et al。cDNA cloning and genomic struc ture of human bone morphogenetic protein 3B。Biochem-biophys-Res-Comm un，1996 ，223：3041. 10 Hogan BL.bone morphogenetic proteins:multifunctional regulators of vertebratedevelopmentJ.Genes Dev,1996,10:1580-1594 11 吕中法.毛乳头细胞