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文档简介
6-磷酸葡萄糖异构酶检测在类风湿关节炎中的意义 类风湿关节炎诊断以往检测指标是靠类风湿因子(rheumatoid factor, RF) ,近来的抗胍氨酸 环肽抗体(抗 CCP 抗体)已经把 RA 检测的敏感性和特异性有所提高,但是 RA 病人体内 存在的多种自身抗体和很多其他生化异常,候选的抗原还有型还原、热休克蛋白 60、角 蛋白和软骨糖蛋白 39 等。最近发现葡萄糖-6-磷酸-异构酶(glucose-6- phosphateisomerase, GPI)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)病人血清和关 节液中明显增高,甚至还有报道认为抗 GPI 抗体与 RA 相关,本文旨在评估 GPI 在 RA 病人 和其他自身免疫病人的血清中的浓度是否有差异。 1 材料 1.1 病人和临床资料 所有 198 例病人均来自仁济医院门诊或住院病人,其中 RA 病人 100 例,包括男性 31 人,女性 69 人。年龄最小 12 岁,最大 68 岁,平均 5012.9 岁,另 外有 98 例非 RA 病人作为对照,其中 SLE 病人 32 例,OA 病人 20 例,AS 病人 20 例,PM/DM 病人 14 例,SS 病人 12 例,对照组包括男性 43 人,女性 55 人,年龄最小 16 岁,最大 67 岁,平均速度 815.9 岁。所有病人均符合 ACR 修订的诊断分类标准。 1.2 RA 病人活动的判定 判断标准:关节肿胀6 个;关节压痛6 个;晨僵 45 分钟;血沉(ESR)30mm/h;C 反应蛋白大于正常值上限的 1.5 倍。RA 病人存 在+同时伴有、三项的任何两项被认为活动:不同时满足+或、 仅一项,认为不活动或活动度低。 2.1 检测方法 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法( ELISA)检测病人血液中的葡萄糖 6 磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI) 。试剂盒由上海北加生化试剂有限公 司提供。 2.2 试验步骤 病人血清按 110 稀释于样品稀释液中。检测时加阳性、对照阴性对 照和 GPI 标准品(0、0.16、0.33、1.0、2.0g/m)各 100l,371 小时。弃样本后 PBS 洗板 3 次,再加入酶标抗体,371 小时,再次 FBS 洗板 3 次,加 TAB 显色液 100l 显色 10 分钟后,2M 硫酸 50l 终止显色,酶标仪(Hio-Rad550)490nm 读板,参比波长 630nm。 2.3 结果判定 实验结果根据标准品的浓度和吸光度(OD 值)做直线回归,浓度为 横坐标,OD 值位纵坐标,尝试在 2.0g/ml 为直线。根据文献 0.16g/ml 以下定为正常, 0.160.33g/ml 以内为可疑,大于 0.33g/ml 为阳性。 3. 结果统计 用 SAS6.12 软件包,采用 exact Chisque 对各组数据进行卡方检验。 对 RA 患者年龄、发病时间、肿痛数、X 线分期、HAQ、VAS、RF、ESR 等数据进行 Logistic 回归分析。 4. 实验结果 病人检测的浓度分布见图 1,RA 病人血清 GPI 浓度超时 0.16g/ml 的 比率是 35%,阳性率为 28%,对照组超过 0.16g/ml 的比率是 13.3%,阳性率为 2%,其 特异性高达 97.9%,阳性预测值为 93.3%。同时 RA 组血清 GPI 浓度超过计划 2.0g/ml 的病人(23%)明显高于对照组对(0%) (表 1) 。通过对 RA 患者进行 Logistic 回归分析 发现仅关节肿胀疼痛数与 GPI 浓度有相关性(表 2) 。 各组病人的 GPI 浓度分布 注:RA-A=RA 活动组,RA-NA=RA 不活动组 0.16g/ml, 0.33g/ml 表 1:各组 GPI 浓度分级一览表 血清 GPI 浓度(g/ml) 2 RA 组(n=100)* 65 7 5 23 RA 活动组 (n=65) RA 不活动组 (n=35) 对照组(n=98) SLE 组(n=32) AS 组(n=20 ) OA 组( n=20) PM/DM 组 (n=14) SS 组(n=12 ) 39 26 85 26 20 20 10 9 3 4 11 4 0 0 4 3 4 1 2 2 0 0 0 0 19 4 0 0 0 0 0 0 *RA 组和对照组 X2=27.824,P0.001。 表 2:Logistic 回归分析结果 平均年龄发病时间关节肿痛 X 线分明 HAQ VAS ESR RF 阳性率(%) (年)胀数 RA 组 P 值 5012.9 0.560 1011 0.520 125 0.0029 2.31.6 0.500 23.88.6 0.240 6.23.1 0.063 6336 0.220 64.5 0.200 odds ratio=0.865 5.讨论 GPI 又称为 D-葡萄糖-6-磷酸- 酮异构酶(D-glucose-6-phosphate ketol-isomerase) ,主要 功能是催化 6-磷酸葡萄糖和 6 磷酸果糖转化。最早在 1968 年因为非球形红细胞溶血性贫 血而得到认识。近来在 T 细胞受体的转基因小鼠模型(K/B XN)中,小鼠所发生的炎症性 关节炎与人类 RA 相似,而且会持续产生抗 GPI 抗体。2001 年 Schaller2等在 RA 血清、 关节液中检测到高水平的抗 GPI 抗体(64%) ,而 Lyme 病相关的关节炎、 SS 和正常人群 (3%)则很少,并认为该抗体与 RF 无相关性。此外,还在 RA 病人的关节液和血清中发 现高浓度的 GPI 及其免疫复合物,通过共聚焦显微镜和免疫组化发现 RA 病人肥大滑膜或 滑膜绒毛的小动脉和毛细血管有高密度的 GPI 表达,可能是由血管内皮生长因子 (VEGF )所引起。Schaller 等认为 GPI 是通过内皮细胞或者滑液中的可溶性蛋白递呈给免 疫系统,并认为 GPI 抗体在 RA 的病理过程中起作用。但是随后的一些研究都否认了这一 观点3,认为抗 GPI 抗体并非 RA 的特异性抗体,而且该抗体在 RA 病人的阳性率很低。 Matsumoto4 等在不同 RA 病人组测得的抗体阳性率在 1229%,平均在只有 15%,在活 动组 RA 病人、牛皮癣关节炎组等关节炎组的阳性率高一点,而 Herve 等5在 RA 病人中 则没有检测到抗 GPI 抗体,这些差异一部分可能源于试验方法,但是抗 GPI 抗体本身可能 并不是 RA 的标记性抗体。 既然抗 GPI 抗体可能对 RA 的诊断无帮助,但是在 RA 病人血清和关节液中明显增高 的 GPI 是否会对 RA 有帮助,或者成为 RA 病人病情活动的标记之一。试验结果显示 RA 病人组较对照组的血清中 GPI 浓度显著增高(P0.001 ) ,尤其大于 2g/ml 的病例数显著多, 而且与关节肿胀和疼痛成正相关,而 SLE、PM/DM 、SS 病人高于 0.33g/ml 的比率分别为 2%、0%和 0%,而 OA 和 AS 病人的 GPI 浓度则在正常范围内,这说明 GPI 在部分 RA 病 人中升高是有一定特异性,而且和活动有一定关系。尤其我们发现其特异性高达 97.9%, 阳性预计值高达 93.3%,因此有理由认为 GPI 有可能成为 RF 和抗 CCP 抗体以外第三种标 记物,但这还需要进一步扩大样本和疾病的检测范围。 GPI 浓度在部分 RA 病人血清中的浓度增高的原因还不清楚,GPI 作为一种泛在表达的抗 原,能诱导 K/BXN 发生关节炎,后来, 1986 年 Gurney 等 1在鼠的腺体发现 56kd 的神经 白介素(Neuroleukin,NLK)能体外培养的胚胎脊柱神经元在体外的存活,1988 年 C
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