病理学技术复习题

1.何何谓谓超薄切片？超薄切片？ 由于由于电镜电电镜电子束穿透能力的限制，必子束穿透能力的限制，必须须把把标标本切成厚度小于本切成厚度小于 0.1um 以下的薄以下的薄 片才适用，片才适用，这这种薄片称种薄片称为为超薄切片。常用的超薄切片厚度是超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50 至至 70nm。 。 2.透射透射电镜标电镜标本取材的基本要求有哪些？本取材的基本要求有哪些？ 为为了使了使细细胞胞结结构尽可能保持生前状构尽可能保持生前状态态，必，必须须做到快、小、准、冷：做到快、小、准、冷：(1) 动动作迅作迅 速，速，组织组织从活体取下后从活体取下后应应在最短在最短时间时间内内 (争取在争取在 1 分分钟钟内内) 投投 2.5%戊二戊二醛醛固定固定 液。液。(2)所取所取组织组织的体的体积积要小，一般不超要小，一般不超过过 1mm1mm1mm。也可将。也可将组织组织修修 成成 1mm1mm2mm 大小大小长长条形。因条形。因为为固定固定剂剂的渗透能力的渗透能力较较弱，弱，组织块组织块如果太如果太 大，大，块块的内部将不能得到良好的固定。的内部将不能得到良好的固定。(3)机械机械损伤损伤要小，解剖器械要小，解剖器械应锋应锋利，操利，操 作宜作宜轻轻，避免，避免牵牵拉、挫拉、挫伤伤与与挤压挤压。 。(4)操作最好在低温操作最好在低温(04)下下进进行，以降行，以降 低低酶酶的活性，防止的活性，防止细细胞自溶。胞自溶。(5)取材部位要准确。取材部位要准确。 3.电镜标电镜标本的固定与普通光本的固定与普通光镜标镜标本的固定有何不同？本的固定有何不同？ 一）一）.常用固定常用固定剂剂有有 1、四氧化、四氧化锇锇:有有强强烈的烈的电电子染色作用，用它固定的子染色作用，用它固定的样样品品图图 象反差象反差较较好。好。2戊二戊二醛醛:优优点是点是对对糖原、糖蛋白、微管、内糖原、糖蛋白、微管、内质质网和网和细细胞基胞基质质等有等有 较较好的固定作用，好的固定作用，对组织对组织和和细细胞的穿透力比四氧化胞的穿透力比四氧化锇强锇强， ，还还能保存某些能保存某些酶酶的活的活 力，力，长时间长时间的固定的固定(几周甚至几周甚至 12 个月个月)不会使不会使组织变组织变脆。缺点是不能保存脂肪，脆。缺点是不能保存脂肪， 没有没有电电子染色作用，子染色作用，对细对细胞膜的胞膜的显显示示较较差。二）差。二）.组织块组织块固定常固定常规规采用戊二采用戊二醛醛 锇锇酸双重固定法。分酸双重固定法。分预预固定和后固定，中固定和后固定，中间间用磷酸用磷酸缓缓冲液漂洗。固定完冲液漂洗。固定完毕毕，用，用缓缓 冲液漂洗冲液漂洗 20 分分钟钟后后进进行脱水。行脱水。 电镜电镜 光光镜镜 固定固定剂剂， ， 四氧化四氧化锇锇、戊二、戊二醛醛。 。10%福福尔马尔马林或林或 4%甲甲醛醛 固定方固定方 法法 戊二戊二醛醛-锇锇酸双重固定法。酸双重固定法。 蒸汽固定、灌注固定。蒸汽固定、灌注固定。 目的目的 除了一般光学除了一般光学标标本固定目的外，本固定目的外，还还有有 电电子染色作用。子染色作用。 将将组织结组织结构尽量接近与它生构尽量接近与它生 前的状前的状态态。 。 标标本本 1mm1mmmm厚度厚度 3-4mm 左右左右 4.电镜标电镜标本包埋操作中本包埋操作中应应注意的事注意的事项项有哪些？有哪些？ 包埋操作中包埋操作中应应注意以下几点：注意以下几点：(1)所有所有试剂试剂要防潮，最好存放在干燥器中；要防潮，最好存放在干燥器中；(2) 所用器皿所用器皿应应烘干；烘干；(3)配包埋配包埋剂时剂时，每加入一种，每加入一种试剂试剂要要搅搅拌均匀；拌均匀；(4)包埋包埋 时动时动作作 要要轻轻巧，防止巧，防止产产生气泡；生气泡；(5)皮肤尽量不要接触包埋皮肤尽量不要接触包埋剂剂，以免引起皮炎；，以免引起皮炎；(6)盛放盛放过过 包埋包埋剂剂的容器要及的容器要及时时用丙用丙酮酮清洗干清洗干净净。 。 5.超薄切片超薄切片观观察前察前进进行半薄切片光学行半薄切片光学显显微微镜观镜观察的目的是什么？察的目的是什么？ 半薄切片半薄切片进进行光学行光学显显微微镜观镜观察的目的：察的目的：(1) 定位：通定位：通过过光学光学显显微微镜观镜观察，确定察，确定 所要所要观观察的范察的范围围，然后保留要用，然后保留要用电镜观电镜观察的部分，修去其余部分。察的部分，修去其余部分。(2)便于便于对对同同 一一组织组织的同一部位的同一部位进进行光学行光学显显微微镜镜和和电镜电镜的的对对比比观观察。察。 6.电镜标电镜标本本为为什么要染色，染色方法及常用的染色什么要染色，染色方法及常用的染色剂剂分分别别是什么？是什么？ 未未经经染色的超薄切片，反差很弱。因此，要染色的超薄切片，反差很弱。因此，要进进行染色行染色处处理，以增理，以增强样强样品的反差。品的反差。 一般是用重金属一般是用重金属盐盐与与组织细组织细胞中某些成分胞中某些成分结结合或被合或被组织组织吸附来达到染色的目吸附来达到染色的目 的。重金属的原子的。重金属的原子对电对电子束形成散射，从而提高子束形成散射，从而提高图图象的反差。象的反差。 常用的染色常用的染色剂剂有醋酸有醋酸铀铀和和柠柠檬酸檬酸铅铅。染色方法有两种：。染色方法有两种：1 组织块组织块染色：染色： 2切片染色切片染色 7.电电子子显显微微镜镜在病理学中主要用于哪些方面？在病理学中主要用于哪些方面？ 病理学中的病理学中的应应用用 1.肾脏肾脏疾病疾病(肾肾小球小球肾肾炎炎)及肌病中及肌病中应应用：用：轻轻微病微病变变性性肾肾小小 球球肾肾炎、弥漫性膜性炎、弥漫性膜性肾肾小球小球肾肾炎、膜性增生性炎、膜性增生性肾肾小球小球肾肾炎炎 2 肿肿瘤中的瘤中的应应用：用：电镜检查电镜检查能能够发挥够发挥最大最大诊诊断潜能的、断潜能的、电镜检查电镜检查能提供多能提供多 半半诊诊断性信息的断性信息的 8.在哪些情况下在哪些情况下电镜检查电镜检查在病理在病理诊诊断中能断中能够发挥够发挥最大最大诊诊断潜能断潜能 电镜检查电镜检查能能够发挥够发挥最大最大诊诊断潜能的：断潜能的：1） ）.通通过发现过发现所所谓谓的神的神经经分泌型致密核分泌型致密核 心心颗颗粒，粒，证证明明肿肿瘤的（神瘤的（神经经）内分泌性）内分泌性质质。 。2.） ）评评估具有估具有颗颗粒状胞粒状胞浆浆（嗜酸性（嗜酸性细细 胞，胞，颗颗粒粒细细胞，内分泌胞，内分泌细细胞）的胞）的肿肿瘤瘤细细胞的性胞的性质质。 。3） ）.确定不同确定不同类类型型肿肿瘤中的瘤中的 上皮分化（包括腺体和上皮分化（包括腺体和鳞鳞状分化）。状分化）。4） ）.通通过检测过检测黑色素小体黑色素小体证证明明肿肿瘤的黑色瘤的黑色 素素细细胞性胞性质质。 。5.通通过检测过检测 Birbeck 颗颗粒，粒，证证明病明病变变属于朗格罕属于朗格罕细细胞胞组织细组织细胞胞 增生症范畴。增生症范畴。6.通通过发现过发现大量的滑面内大量的滑面内质质网和具有管泡状网和具有管泡状嵴嵴的的线线粒体，粒体，证证明明 肿肿瘤由来自瘤由来自肾肾上腺皮上腺皮质质和性腺的和性腺的产产生生类类固醇的固醇的细细胞胞组组成。成。7.通通过检测过检测 WeibelPalade 小体，小体，证证明明肿肿瘤的血管内皮瘤的血管内皮细细胞性胞性质质。 。8.通通过检测过检测各个系各个系统统 的的细细胞胞浆浆微微丝丝，确，确认认骨骼肌和平滑肌骨骼肌和平滑肌细细胞。胞。9.通通过检测过检测中中轴轴突和其他特征，突和其他特征， 确确认认神神经经鞘鞘细细胞。胞。10.通通过检测过检测特征性的有界膜的晶体，特征性的有界膜的晶体，证证明腺泡状明腺泡状软组织软组织 肉瘤。肉瘤。11.确确认认 GIST 家族家族肿肿瘤中平滑肌，神瘤中平滑肌，神经经或其他或其他类类型的分化。型的分化。 9.电镜检查电镜检查的局限性有哪些？的局限性有哪些？ 1.无无论论在哪一点取在哪一点取样样，用于研究的只是，用于研究的只是肿肿瘤的一小部分。瘤的一小部分。 2.缺少真正的特异性超微缺少真正的特异性超微结结构特征，因构特征，因为专为专属于一种属于一种细细胞或胞或组织类组织类型的型的 细细胞器或其他胞器或其他结结构的数量很少。构的数量很少。 3.可能将混可能将混杂杂在在肿肿瘤中的非瘤中的非肿肿瘤性成分瘤性成分误认为肿误认为肿瘤。瘤。应应当承当承认认，任何技，任何技术术 均有均有这这种可能性，但在种可能性，但在电镜检查时电镜检查时尤尤为为突出，因突出，因为为在一在一块块小的小的组织样组织样本本 中中评评估空估空间间关系是困关系是困难难的。的。 4.无法无法鉴鉴定同一定同一细细胞胞类类型的反型的反应应性病性病变变、良性、良性肿肿瘤和瘤和恶恶性性肿肿瘤之瘤之间间。 。 5.电镜检查费电镜检查费用昂用昂贵贵。 。 应应用用电镜检查电镜检查最好的最好的时时机是，病理医机是，病理医师师已在光已在光镜镜水平将水平将肿肿瘤的瘤的鉴别诊鉴别诊 断确定在断确定在 2 或或 3 种种肿肿瘤之瘤之间间，只有当超微，只有当超微结结构特征与光构特征与光镜镜特征特征紧紧密密联联 系系时时， ，诊诊断性的断性的电镜观电镜观察才能提供完整的信息，正如光察才能提供完整的信息，正如光镜镜表表现现与大体病与大体病 理和理和临临床特征相床特征相结结合合时时才具有完整的意才具有完整的意义义一一样样。 。 流式流式细细胞胞术术复复习题习题 1. 什么是流式什么是流式细细胞胞术术？试试述流式述流式细细胞胞术样术样本制本制备备的基本原的基本原则则。 。 流式流式细细胞胞术术是利用流式是利用流式细细胞胞仪进仪进行的一种行的一种单细单细胞定量分析和分胞定量分析和分选选技技术术， ， 是是单单克隆抗体及免疫克隆抗体及免疫细细胞化学技胞化学技术术、激光和、激光和电电子子计计算机科学等高度算机科学等高度发发展及展及 综综合利用的高技合利用的高技术产术产物。物。 它可以高速分析上万个它可以高速分析上万个细细胞，并能同胞，并能同时时从一个从一个细细胞中胞中测测得多个参数得多个参数;与与传传 统统的的荧荧光光镜检查镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等相比，具有速度快、精度高、准确性好等优优点，成点，成为为当代最当代最 先先进进的的细细胞定量分析技胞定量分析技术术。 。 流式流式细细胞胞术样术样本制本制备备的基本原的基本原则则。 。 1.用于用于 FCM 的的样样本是本是单单细细胞胞悬悬液液 ;2.使各种体液和使各种体液和悬悬浮浮细细胞胞样样本本新新鲜鲜 ;3. 针对针对不同的不同的细细胞胞样样本本进进行适当的洗行适当的洗涤涤， ，酶酶消化或消化或 EDTA 处处理理； ；4.新新鲜实鲜实体瘤体瘤 组织组织可可选选用或用或联联用用酶酶消化法、机械打散法和化学分散法来消化法、机械打散法和化学分散法来获获得足得足够够数量的数量的 单细单细胞胞悬悬液。液。 2.什么是流式什么是流式细细胞胞仪仪的基本的基本结结构构? 1.传传感系感系统统:包括包括样样本本递递送系送系统统、 、样样品池、品池、检测检测系系统统、 、电电子子传传感器和激光源等感器和激光源等; 2.计计算机系算机系统统 ;3.电电路、光路和水路系路、光路和水路系统统 :有有电电源、光学源、光学传导传导和和滤滤片、鞘液循片、鞘液循 环环和回收部分等。和回收部分等。 3.流式流式细细胞胞术临术临床常床常应应用于哪些用于哪些领领域域? 1.外周血外周血细细胞的免疫表型胞的免疫表型测测定和定量分析；定和定量分析；2.某一特定某一特定细细胞群的胞群的筛选筛选和和细细胞胞 收集；收集；3.细细胞耐胞耐药药基因的基因的检测检测； ；4.癌基因和抑癌基因的癌基因和抑癌基因的检测检测； ；5.细细胞凋亡的定胞凋亡的定 量研究、量研究、细细胞毒功能胞毒功能检测检测； ；6.细细胞内某些蛋白胞内某些蛋白质质和核酸的定量分析。和核酸的定量分析。 （一）在（一）在肿肿瘤学中的瘤学中的应应用：用：协协助助肿肿瘤早期瘤早期诊诊断断 。 。FCM 可精确定量可精确定量 DNA 含量含量 的改的改变变，作，作为诊为诊断癌前病断癌前病变发变发展至癌展至癌变变中的一个有价中的一个有价值值的的标标志，能志，能对对癌前病癌前病 变变的性的性质质及及发发展展趋势趋势作出估价，有助于癌作出估价，有助于癌变变的早期的早期诊诊断断 。 。 （二）在（二）在细细胞免疫中的作用胞免疫中的作用： ：FCM 通通过荧过荧光抗原抗体光抗原抗体检测检测技技术对细术对细胞表面抗胞表面抗 原分析，原分析，进进行行细细胞分胞分类类和和亚亚群分析。用群分析。用 FCM 还还可以可以监测肾监测肾移植后病人的移植后病人的肾肾 排斥反排斥反应应。 。 （三）在血液病（三）在血液病诊诊断和治断和治疗疗中的中的应应用用： ：FCM 通通过对过对外周血外周血细细胞或骨髓胞或骨髓细细胞表胞表 面抗原和面抗原和 DNA 的的检测检测分析，分析，对对各种血液病的各种血液病的诊诊断、断、预预后判断和治后判断和治疗疗起着起着举举 足足轻轻重的作用。重的作用。(1) 白血病的白血病的诊诊断和治断和治疗疗；（；（2）造血干）造血干细细胞移植技胞移植技术术。 。 4.什么是基因芯片什么是基因芯片? 目前基因芯片主要目前基因芯片主要应应用于哪些用于哪些领领域域? 1）基因芯片又称）基因芯片又称 DNA 芯片芯片(DNAcMp)，是指固着在固相，是指固着在固相载载体上的高密度的体上的高密度的 DNA 微点微点阵阵。具体地。具体地说说就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度就是将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度 地排列在如硅片、玻璃片、聚丙地排列在如硅片、玻璃片、聚丙烯烯或尼或尼龙龙膜等膜等载载体上，体上，这这就是基因芯片。就是基因芯片。 （ （2） ）目前基因芯片主要目前基因芯片主要应应用于哪些用于哪些领领域域? （ （1） ）测测 序序：基因芯片利用固定探：基因芯片利用固定探针针与与样样品品进进行分子行分子杂杂交交产产生的生的杂杂交交图谱图谱而排而排 列出待列出待测样测样品的序列。品的序列。 （ （2） ）基因表达水平的基因表达水平的检测检测：用基因芯片：用基因芯片进进行的表达水平行的表达水平检检 测测可自可自动动、快速地、快速地检测检测出成千上万个基因的表达情况。出成千上万个基因的表达情况。 （ （3） ）基因基因诊诊断断：从正常人：从正常人 的基因的基因组组中分离出中分离出 DNA 与与 DNA 芯片芯片杂杂交就可以得出交就可以得出标标准准图谱图谱；从病人的基；从病人的基 因因组组中分离出中分离出 DNA 与与 DNA 芯片芯片杂杂交就可以得出病交就可以得出病变图谱变图谱；通；通过过比比较较、分析、分析 这这两种两种图谱图谱，就可以得出病，就可以得出病变变的的 DNA 信息。信息。 （ （4） ）药药物物筛选筛选：利用基因芯片分析：利用基因芯片分析 用用药药前后机体的不同前后机体的不同组织组织、器官基因表达的差异、器官基因表达的差异,从基因水平解从基因水平解释药释药物的作用物的作用 机理。机理。 5.什么是什么是组织组织芯片芯片? 组织组织芯片的特点芯片的特点 组织组织芯片芯片(tissue chip)又称又称组织组织微微阵阵列列 (tissue microarray)；是将数十个至数；是将数十个至数 百个小的百个小的组织组织片整片整齐齐地排列在某一地排列在某一载载体上而成的微体上而成的微缩组织缩组织切片；切片；组织组织芯片的特芯片的特 点：点：体体积积小，信息量大，能高效、快速和低消耗地小，信息量大，能高效、快速和低消耗地进进行各种原位行各种原位组织组织学的研究和学的研究和 观观察，并有察，并有较较好的内好的内对对照及照及实验实验条件的可比性。条件的可比性。 免疫免疫组组化复化复习题习题 1.试试述免疫述免疫组组化的基本原理及主要化的基本原理及主要优优点。点。 应应用免疫学及用免疫学及组织组织化学原理，化学原理，对组织对组织切片或切片或细细胞胞标标本中某些化学成分本中某些化学成分进进行行 原位定性、定位或定量研究，原位定性、定位或定量研究，这这种技种技术术称称为为免疫免疫组织组织化学技化学技术术 (immunohistochemistry)或免疫或免疫细细胞化学技胞化学技术术(immunocytochemistry)。 。 主要主要优优点点： ：1.原位的化学原位的化学 。 。2.呈色反呈色反应应。 。3.形形态态、代、代谢谢、功能三、功能三结结合。合。4.方法上一方法上一 通百通。通百通。5.定性可靠、定位准确、定量可靠（特异性定性可靠、定位准确、定量可靠（特异性强强，敏感性高）。，敏感性高）。6.跨学科的跨学科的 广泛广泛应应用。用。 2常用的免疫常用的免疫组组化方法有哪些？化方法有哪些？ 按按标记标记物物质质： ： 1.免疫免疫荧荧光法；光法； 2.放射免疫法；放射免疫法；3.酶标酶标法；法；4.免疫金免疫金银银法。法。 按染色步按染色步骤骤： ： 直接法；直接法； 间间接法接法 按按结结合方式：合方式： 抗原抗原-抗体抗体结结合（合（PAP 法）法）亲亲和和连连接（接（ABC 法、法、SP 法）法） 3简简述免疫述免疫组组化在病理化在病理诊诊断和研究中的作用。断和研究中的作用。 1.确定确定细细胞胞类类型型 ； ； 2.辨辨认细认细胞胞产产物物 ； ； 3.了解分化程度了解分化程度 4.鉴鉴定病定病变变性性质质 5.发现发现微小病灶微小病灶 ； ； 6.探探讨肿讨肿瘤起源或分化表型瘤起源或分化表型 ； ；7.确定确定肿肿瘤分期瘤分期 8.指指导导治治疗疗和和预预后；后； 9.辅辅助疾病助疾病诊诊断和分断和分类类； ； 10.寻寻找感染病因找感染病因 4.免疫免疫组组化中化中组织组织固定的目的是什么？固定的目的是什么？组织组织固定固定应应注意哪些注意哪些问题问题? 为为更好保持更好保持细细胞和胞和组织组织原有形原有形态结态结构，防止构，防止组织组织自溶，有必要自溶，有必要对细对细胞和胞和组织组织 进进行固定。固定的作用不行固定。固定的作用不仅仅是使是使细细胞内蛋白胞内蛋白质质凝固凝固,终终止或抑制外源性和内止或抑制外源性和内 源性源性酶酶活性活性,更重要的是最大限度地保存更重要的是最大限度地保存细细胞和胞和组织组织的形的形态结态结构和抗原性构和抗原性,使使 水溶性抗原水溶性抗原转变为转变为非水溶性抗原非水溶性抗原,可有效防止可有效防止组织组织自溶坏死、抗原自溶坏死、抗原丢丢失弥散。失弥散。 组织组织固定固定应应注意哪些注意哪些问题问题? 1.标标本离体后本离体后 30 分分钟钟内内应进应进入固定液或入固定液或贮贮存于液氮罐内或存于液氮罐内或-70冰箱内低温冰箱内低温 保存。保存。2.空腔器官需依照空腔器官需依照规规范方法剪开后固定。范方法剪开后固定。3.实质实质性器官性器官须须由器官背面，由器官背面， 沿沿长轴长轴每每间间隔隔 2cm 纵纵向平行剖开，切成数片再固定。向平行剖开，切成数片再固定。4.微小微小组织组织和液体沉淀和液体沉淀 物，物，须须先用拭先用拭纸纸或或滤纸滤纸妥妥为为包裹后固定。包裹后固定。 5.为为什么要什么要进进行抗原修复？抗原修复方法有哪些？行抗原修复？抗原修复方法有哪些？ 因因为为部分抗原在甲部分抗原在甲醛醛固定固定过过程中程中发发生蛋白之生蛋白之间间的交的交联联及及醛醛基的封基的封闭闭作用而作用而 遮蔽抗原决定簇，使免疫遮蔽抗原决定簇，使免疫组组化化标记标记敏感性明敏感性明显显降低。通降低。通过过抗原修复，使得抗原修复，使得细细 胞内抗原决定簇重新暴露。胞内抗原决定簇重新暴露。 抗原修复方法有抗原修复方法有： ：化学方法：化学方法：酶酶消化方法，常用有胰蛋白消化方法，常用有胰蛋白酶酶及胃蛋白及胃蛋白酶酶； ； 物理方法：物理方法：热热引引导导抗原决定簇修复，常用有抗原决定簇修复，常用有单纯单纯加加热热、微波、微波处处理和高理和高压压加加热热。 。 6.免疫免疫组组化染色中一般化染色中一般应设应设置哪些置哪些对对照？照？ 免疫免疫组组化染色中化染色中对对照片照片设设置非常重要，它是判断染色是否成功的关置非常重要，它是判断染色是否成功的关键键依据，依据， 而且也是而且也是检测检测每一个抗体的每一个抗体的质质量量标标准，没有准，没有对对照的免疫照的免疫组组化化结结果是毫无意果是毫无意 义义的。的。包括阴性包括阴性对对照、阳性照、阳性对对照和自身照和自身对对照。替代照。替代对对照，回收照，回收实验实验阴性阴性对对照。照。 阴性阴性对对照照 一抗由一抗由 PBS 或非免疫血清取代。或非免疫血清取代。阳性阳性对对照照 用已知含有用已知含有检测检测抗抗 原的切片作阳性原的切片作阳性对对照。照。自身自身对对照照 如如 actin、 、CD34 在正常在正常组织组织中血管壁肌中血管壁肌层层 应为应为阳性，阳性，vimentin 可以可以间质细间质细胞胞对对照，照， desmin 以血管壁及肌束以血管壁及肌束为对为对照，照， S-100 蛋白以神蛋白以神经经末梢末梢为对为对照等，如照等，如应为应为阳性的阳性的组织组织是阳性，是阳性，则则免疫免疫组组化技化技 术术正确，如正确，如为为阴性，阴性，则则表明染色技表明染色技术术或或试剂质试剂质量有量有问题问题。 。 形形态态学技学技术术与方法概与方法概论论复复习题习题 1.分辨力与放大倍数。分辨力与放大倍数。分辨力分辨力：区分两点：区分两点间间最小距离的本最小距离的本领领。 。放大倍数放大倍数：用：用显显微微 镜镜放大放大镜镜放大物体至肉眼能放大物体至肉眼能观观察到的程度；在一定范察到的程度；在一定范围围内（不超内（不超过过分辨力），放分辨力），放 大倍数越大，肉眼大倍数越大，肉眼观观察到的物体就越清楚。察到的物体就越清楚。 2.肉眼：肉眼：肉眼能直接肉眼能直接观观察到的事物的限度察到的事物的限度为为 0.1mm。 。 3.暗暗视视野野显显微微镜镜： ：应应用：用：观观察因反差或分辨力不足的微小察因反差或分辨力不足的微小颗颗粒，如梅毒螺旋体、粒，如梅毒螺旋体、 细细菌等微粒的运菌等微粒的运动动。可分辨。可分辨 0.004um-0.2um 微粒微粒 4.透射透射电电子子显显微微镜镜： ：电电子束子束为为“光源光源”,以以电电磁磁为为透透镜镜，分辨力，分辨力为为 0.1nm-0 2nm， ， 放大倍数放大倍数 80100 万倍万倍(0.1mm/0.1nm)，成像原理，成像原理:电电子散射子散射不同不同组织结组织结构构 对电对电子的散射能力有差子的散射能力有差别别（用重金属（用重金属盐盐-醋酸醋酸铀铀、硝酸、硝酸铅铅染色可提高反差）。染色可提高反差）。 5.扫扫描描电电子子显显微微镜镜： ：原理：利用从原理：利用从标标本表面反射回来的二次本表面反射回来的二次电电子成像特点，景深子成像特点，景深 长长，成像有立体感：可，成像有立体感：可观观察物体表面凹凸不平的察物体表面凹凸不平的细节细节， ，标标本制本制备简单备简单，分辨本，分辨本 领领可达可达 600nm。 。 图图像分析复像分析复习题习题 一一.什么是什么是图图像的定性分析和定量分析？像的定性分析和定量分析？ 图图像的定性分析是指用肉眼、像的定性分析是指用肉眼、显显微微镜镜、 、电镜电镜等等观观察察图图像像结结果后果后对图对图像的像的结结构构 特点和含特点和含义义所作的描述、分析、推理和判断。所作的描述、分析、推理和判断。 图图像的定量分析是指用量化的方法一数字的表达形式像的定量分析是指用量化的方法一数字的表达形式对图对图像中各种像中各种结结构信构信 息的定量描述及在此基息的定量描述及在此基础础上上对图对图像含像含义义所做的定量分析、推理、判断和概括。所做的定量分析、推理、判断和概括。 通常所通常所说说的的图图像分析特像分析特别别是是计计算机算机图图像分析一般指的都是像分析一般指的都是图图像定量分析像定量分析. 二二.图图像分析和像分析和图图像像处处理有什么不同？理有什么不同？ 图图像分析和像分析和图图像像处处理是有密切理是有密切联联系但又不同的两个概念，系但又不同的两个概念，图图像像处处理本理本质质上是上是 指指对图对图像的修像的修饰饰，通，通过这过这种修种修饰饰去除去除图图像的缺陷或不足，将模糊像的缺陷或不足，将模糊图图像像变为变为清晰清晰 图图像或以新的像或以新的图图像形式来表达原像形式来表达原图图像等。像等。图图像分析包括像分析包括图图像的定性分析和定像的定性分析和定 量分析。量分析。 三三.什么是数什么是数值图值图像？像？ 所所谓谓数数值图值图像就是把像就是把图图像画面划分成由数字化的像素集所构成的像画面划分成由数字化的像素集所构成的图图像。是像像。是像 素灰度素灰度值值的二的二维维数数组组。 。 四四.什么是形什么是形态测态测量学？量学？ 是指定量是指定量测试测试和分析和分析组织组织宏宏观观或微或微观观水平的二水平的二维维和三和三维结维结构的原理、方法及构的原理、方法及 其其应应用的一用的一门门科学。它通科学。它通过过有关量化指有关量化指标标反映反映组织组织的的结结构特点。构特点。 五五.什么是几何校正？什么是光密度校正？什么是几何校正？什么是光密度校正？ 几何校正是将一几何校正是将一标标准尺度准尺度输输入入计计算机算机图图像分析系像分析系统统， ，计计算机根据算机根据该该尺度就尺度就 可确定出可确定出该标该标准尺度准尺度输输入的条件下有关入的条件下有关图图像的尺度像的尺度单单位，及位，及图图像中每一像素像中每一像素 所代表的所代表的实际实际尺寸，尺寸，这这一一过过程通常称程通常称为标为标定。定。 光密度校正也称光密度校正也称为为光密度光密度标标定，它是将一套定，它是将一套标标准的光密度片通准的光密度片通过显过显微微镜镜和和 （或）（或）摄摄像机像机输输入入图图像分析系像分析系统统并以此并以此为标为标准准对对光密度参数光密度参数进进行校正。行校正。 六六.图图像分割有哪些方法？它像分割有哪些方法？它们们各有什么特点？各有什么特点？ 图图像分割的方法有手像分割的方法有手工分割、灰度分割、和色彩分割。工分割、灰度分割、和色彩分割。 手工分割手工分割：通：通过过手工方法，借助鼠手工方法，借助鼠标标，通，通过过勾描感勾描感兴兴趣的特定趣的特定结结构来构来实现图实现图像像 分割，可与色彩分割相分割，可与色彩分割相结结合。合。 灰度分割灰度分割：是根据所：是根据所设设定的灰度定的灰度阈值进阈值进行行图图像分割，常与手工分割像分割，常与手工分割联联合合应应用。用。 色彩分割色彩分割：就是通：就是通过过指定特定的指定特定的颜颜色，并将色，并将该颜该颜色的色的图图像像结结构提取出来。构提取出来。这这种种 分割方法分割方法对对于特殊于特殊颜颜色色结结构的构的图图像具有良好的分割效果。像具有良好的分割效果。 七七.什么是什么是计计算机算机图图像分析？像分析？ 计计算机算机图图像分析指用像分析指用计计算机算机图图像分析系像分析系统对图统对图像像结结构的定量构的定量测试测试，以及在此，以及在此 基基础础上上对图对图像的定量描述、理解、像的定量描述、理解、识别识别和分和分类类。 。 八八.图图像定量分析的像定量分析的结结构参数大致上可分构参数大致上可分为为哪几大哪几大类类？ 大致上可分几何参数、光密度参数、和特化参数三大大致上可分几何参数、光密度参数、和特化参数三大类类。 。 九九.什么是吸光度（光密度什么是吸光度（光密度 OD）和）和积积分吸光度？分吸光度？ 吸光度（光密度吸光度（光密度 OD）是指光）是指光线线通通过过溶液或某一物溶液或某一物质质前的入射光前的入射光强强度度 I0与与该该光光 线线通通过过溶液或物溶液或物质质后的透射光后的透射光强强度度 Ib比比值值的的对对数，即：数，即：OD=log(I0/Ib).） ） 积积分光密度（分光密度（IOD）：又称）：又称积积分吸光度，分吸光度，为为所所测测范范围围内各像素光密度内各像素光密度值值之和。之和。 十十.在在测试肿测试肿瘤瘤细细胞胞 DI（ （DNA 指数）指数）时时，最好用什么，最好用什么细细胞作胞作标标准二倍体准二倍体对对照？照？ 与与肿肿瘤瘤细细胞同一来源的胞同一来源的细细胞。胞。 十一十一.计计算机算机图图像分析在像分析在肿肿瘤病理学上有哪些瘤病理学上有哪些应应用？用？ 主要是通主要是通过过定量揭示定量揭示肿肿瘤瘤组织组织的形的形态结态结构特征构特征来来阐阐明明肿肿瘤的瘤的发发生、生、发发展、展、诊诊断、断、 分型、分分型、分类类、浸、浸润润、 、转转移、复移、复发发和和预预后等病理学后等病理学问题问题。一）在。一）在肿肿瘤瘤发发生生发发展方面展方面; 二）在病理二）在病理诊诊断、分断、分类类、分型方面、分型方面; 三三)在在肿肿瘤瘤预预后判断方面后判断方面; 四）在四）在肿肿瘤瘤转转移移 和复和复发发方面方面; 五）在五）在肿肿瘤免疫瘤免疫组组化和分子病理学研究方面化和分子病理学研究方面. 十二十二.计计算机算机图图像分析像分析应应用中用中应应注意哪些注意哪些问题问题？ 1.设计设计在先、在先、测试测试在后，注意有关在后，注意有关测试测试所需所需满满足的基本条件。足的基本条件。 2.注意注意计计算机算机图图像分析像分析测试测试并不等于体并不等于体视视学学测试测试，同，同时应时应注意注意计计算机算机图图像分像分 析析测试测试中的中的误误差。差。 3.注意注意测试样测试样本的代表性。本的代表性。 4.注意注意测试测试方法和方法和计计算公式的使用条件。算公式的使用条件。 5.注意注意现现有参数的局限性，注意新参数的开有参数的局限性，注意新参数的开发发和利用。和利用。 6.注意正确理解和解注意正确理解和解释测试释测试参数及参数及结结果的意果的意义义，注意参照空，注意参照空间间的的“陷阱陷阱”问题问题。 。 7.注意多种参数的注意多种参数的联联合合应应用，包括形用，包括形态结态结构参数、构参数、DNA 倍体分析参数、核仁倍体分析参数、核仁 组组成区参数、免疫成区参数、免疫组组化和分子病理学参数。化和分子病理学参数。 8.注意在切片上注意在切片上对对 DNA 进进行定量存在的不足。行定量存在的不足。 9.对对于于计计算机算机图图像定量像定量诊诊断（也包括其他断（也包括其他诊诊断方法），断方法），应应注意注意应应用用诊诊断断试验试验的的 评评价方法和有关价方法和有关评评价指价指标标，如，如诊诊断的灵敏度、特异度、漏断的灵敏度、特异度、漏诊诊率、率、误诊误诊率、阳性率、阳性 预测值预测值、阴性、阴性预测值预测值和准确度等和准确度等进进行科学的行科学的评评价。价。 9.在在临临床病理学床病理学应应用中用中应应在有非常可靠、充分和在有非常可靠、充分和稳稳定的定量定的定量诊诊断和断和鉴别诊鉴别诊断断 结结果依据的基果依据的基础础上逐步上逐步过过渡到渡到临临床床应应用。用。 10.注意将定量病理学与分子病理学注意将定量病理学与分子病理学结结合，注意合，注意发发展分子病理学。展分子病理学。 12.注意以科学的注意以科学的态态度度对对待待计计算机算机图图像分析的像分析的测试结测试结果，果，应应充分看到充分看到计计算机算机图图 像分析的像分析的优优点和局限性，不点和局限性，不应仅仅应仅仅站在站在图图像定量分析的角度片面夸大像定量分析的角度片面夸大计计算算 机机图图像分析的作用，也不像分析的作用，也不应单纯应单纯站在定性的角度而否站在定性的角度而否认认或排斥或排斥计计算机算机图图像像 分析的作用。注意定量数据与定性分析的作用。注意定量数据与定性资资料相料相结结合，充分利用定性合，充分利用定性资资料所包含的料所包含的 各种信息。各种信息。 原位原位杂杂交复交复习题习题 一. 什么是原位什么是原位杂杂交？交？ 原位原位杂杂交（交（In Situ Hybridization Histochemistry , ISH）是核酸分子）是核酸分子杂杂交的一交的一 部分，是将部分，是将组织组织化学与分子生物学技化学与分子生物学技术术相相结结合来合来检测检测和定位核酸的技和定位核酸的技术术。它。它 是用是用标记标记了的已知序列的核苷酸片段作了的已知序列的核苷酸片段作为为探探针针（ （probe），通），通过杂过杂交直接在交直接在组组 织织切片、切片、细细胞涂片或培养胞涂片或培养细细胞爬片上胞爬片上检测检测和定位某一特定的靶和定位某一特定的靶 DNA 或或 RNA 的存在。的存在。 二什么是探二什么是探针针？ 从化学和生物学意从化学和生物学意义义上理解，探上理解，探针针是一种分子，它是一种分子，它带带有供反有供反应应后后检测检测的合适的合适 标记标记物，并物，并仅仅与特异靶分子反与特异靶分子反应应。 。 三三.探探针针的种的种类类及其及其优优缺点比缺点比较较？ 基因探基因探针针分分类类：根据：根据标记标记方法不同可粗分方法不同可粗分为为放射性探放射性探针针和非放射性探和非放射性探针针(包包 括括荧荧光素和非光素和非荧荧光素光素标记标记:地高辛或生物素地高辛或生物素)两大两大类类。根据探。根据探针针的核酸性的核酸性质质不不 同又可分同又可分为为 DNA 探探针针， ，RNA 探探针针， ，cDNA 探探针针， ，cRNA 探探针针及寡核苷酸探及寡核苷酸探 针针等几等几类类， ，DNA 探探针还针还有有单链单链和双和双链链之分。之分。 优优缺点比缺点比较较： ： 1.DNA 探探针针（包括（包括 cDNA 探探针针）的主要）的主要优优点：点：这类这类探探针针多克隆在多克隆在质质粒粒载载体体 中，可以无限繁殖，取之不尽，制中，可以无限繁殖，取之不尽，制备备方法方法简简便。便。DNA 探探针针不易降解（相不易降解（相对对 RNA 而言），一般能有效抑制而言），一般能有效抑制 DNA 酶酶活性。活性。DNA 探探针针的的标记标记方法方法较较成熟，成熟， 有多种方法可供有多种方法可供选择选择，如缺口平移，随机引物法，如缺口平移，随机引物法，PCR 标记标记法等，能用于同位法等，能用于同位 素和非同位素素和非同位素标记标记。 。 2.RNA 探探针针 RNA 探探针针是一是一类类很有前途的核酸探很有前途的核酸探针针，由于，由于 RNA 是是单链单链分子，分子， 所以它与靶序列的所以它与靶序列的杂杂交反交反应应效率极高。早期采用的效率极高。早期采用的 RNA 探探针针是是细细胞胞 mRNA 探探 针针和病毒和病毒 RNA 探探针针， ，这这些些 RNA 是在是在细细胞基因胞基因转录转录或病毒复制或病毒复制过过程中得到程中得到标标 记记的，的，标记标记效率往往不高，且受到多种因素的制效率往往不高，且受到多种因素的制约约。 。这类这类 RNA 探探针针主要用于研主要用于研 究目的，而不是用于究目的，而不是用于检测检测。 。RNA 探探针针和和 cRNA 探探针针具有具有 DNA 探探针针所不能比所不能比拟拟 的高的高杂杂交效率，但交效率，但 RNA 探探针针也存在易于降解和也存在易于降解和标记标记方法复方法复杂杂等缺点。等缺点。 3.寡核酸探寡核酸探针针由于由于链链短，其序列复短，其序列复杂杂度低，分子量小，所以和等量靶位点度低，分子量小，所以和等量靶位点 完全完全杂杂交的交的时间时间比克隆探比克隆探针针短，短，寡核苷酸探寡核苷酸探针针可可识别识别靶序列内靶序列内 1 个碱基的个碱基的 变变化，因化，因为为短探短探针针中碱基的中碱基的错错配能大幅度地降低配能大幅度地降低杂杂交体的交体的 Tm 值值。 。一次可一次可 大量合成寡核苷酸探大量合成寡核苷酸探针针（ （110mg），使得），使得这这种探种探针针价格低廉，与克隆探价格低廉，与克隆探针针一一样样， ， 寡核苷酸探寡核苷酸探针针能能够够用用酶酶学或化学方法修学或化学方法修饰饰以以进进行非放射性行非放射性标记标记物的物的标记标记。最。最 常用的寡核苷酸探常用的寡核苷酸探针针有有 1840 个碱基，目前的合成个碱基，目前的合成仪仪可有效地合成至少可有效地合成至少 50 个碱基的探个碱基的探针针。 。 四四.原位原位杂杂交交组织组织化学技化学技术术的操作流程。的操作流程。 由于核酸探由于核酸探针针的种的种类类和和标记标记物的不同，在具体物的不同，在具体应应用的技用的技术术方法上也各有差异，方法上也各有差异， 但其基本操作流程和但其基本操作流程和应应用原用原则则大致相同。大致可分大致相同。大致可分为为： ：杂杂交前准交前准备备，包括，包括 固定、取材、玻片和固定、取材、玻片和组织组织的的处处理，如何增理，如何增强强核酸探核酸探针针的穿透性、减低背景染色的穿透性、减低背景染色 等；等；杂杂交；交；杂杂交后交后处处理：洗理：洗涤涤显显示（示（visualization）：包括放射性自）：包括放射性自显显 影和非放射性影和非放射性标记标记的的显显色。色。 五五组织预处组织预处理有哪些？它理有哪些？它们们的作用？的作用？ 一一一固定固定 1.保持保持细细胞胞结结构构 2.最大限度地保持最大限度地保持细细胞内胞内 DNA 或或 RNA 的水平；的水平； 3.使探使探针针易于易于进进入入细细胞或胞或组织组织。 。 （二）玻片和（二）玻片和组织组织切片的切片的处处理理 1 玻片的玻片的处处理理.应应用粘附用粘附剂预剂预先涂抹在玻片上，干先涂抹在玻片上，干 燥后待切片燥后待切片时应时应用，以保用，以保证证在整个在整个实验过实验过程中切片不致脱落。程中切片不致脱落。2.增增强组织强组织的通的通 透性和核酸探透性和核酸探针针的穿透性，提高的穿透性，提高杂杂交信号，交信号，3.减低背景染色，减低背景染色， 4防止防止 RNA 酶酶 的的污污染染 在整个在整个杂杂交前交前处处理理过过程都需戴消毒手套。程都需戴消毒手套。 常常规规病理切片复病理切片复习题习题 1.常常规规石蜡切片及染色流程：石蜡切片及染色流程：新新鲜标鲜标本本固定固定洗洗涤涤脱水脱水透明透明浸蜡浸蜡包包 埋埋切片切片烤片烤片脱蜡脱蜡染色染色脱水脱水透明透明封固封固. 1）、）、固定固定：将需要：将需要观观察的察的组织组织构造尽量接近于它生前的正常状构造尽量接近于它生前的正常状态态。 。 a.固定要及固定要及时时，否，否则细则细胞内的胞内的酶酶分解蛋白分解蛋白质质氨基酸氨基酸渗出渗出细细胞或病原微生胞或病原微生 物繁殖而腐物繁殖而腐败败组织结组织结构破坏构破坏 b.原理：使蛋白原理：使蛋白质质沉淀或凝固沉淀或凝固 c.固定固定剂剂的量：的量： 不少于不少于组织组织体体积积的的 4 倍倍 d.固定固定时间时间：根据温度、：根据温度、组织组织大小、及各种固定大小、及各种固定剂剂的穿的穿 透力透力 e.固定容器不能固定容器不能过过小小 f.固定种固定种类类：化学固定：化学固定剂剂、微波（、微波（1970 年年 Mayers 首首 次次应应用）用）g.固定固定剂剂兼有硬化作用兼有硬化作用 .常用固定常用固定剂剂： ： 固定固定剂剂分分为简单为简单（ （单纯单纯）和混）和混 合固定液合固定液. 甲甲醛醛： ：a 又称福又称福尔马尔马林，其英文林，其英文为为（ （Formeldehyde）。市售最高）。市售最高为浓为浓度度为为 40%， ， 用于固定的用于固定的为为 4%，按，按 1： ：9 配制，配制，d.甲甲醛醛渗透力渗透力强强， ，对组织对组织收收缩较缩较少，能使少，能使 组织组织硬化，增加硬化，增加韧韧性性 e.甲甲醛醛容易氧化容易氧化变变成甲酸，使溶液成甲酸，使溶液变变成酸性；放置久成酸性；放置久 后可后可产产生白色沉淀（三聚甲生白色沉淀（三聚甲醛醛） ）f.经经甲甲醛醛固定的固定的陈陈旧旧组织组织（以多血的（以多血的脏脏器如器如 脾、肝等）会脾、肝等）会产产生黑色沉淀称福生黑色沉淀称福尔马尔马林色素林色素 g.甲甲醛醛是一种是一种还还原原剂剂 乙醇：乙醇：a.又称酒精，又称酒精，为为无色液体，能与水在任何比例下混合无色液体，能与水在任何比例下混合 b.既有固定作用，既有固定作用， 也有脱水作用，用来固定的也有脱水作用，用来固定的浓浓度在度在 80%95%c.能沉淀白蛋白、球蛋白和能沉淀白蛋白、球蛋白和 核蛋白，但沉淀的核蛋白能溶于水，故核蛋白，但沉淀的核蛋白能溶于水，故d.渗透力弱，渗透力弱，对组织对组织收收缩缩大，大， 能硬化能硬化组织组织特特别别在高在高浓浓度酒精中度酒精中时间长时间长能使能使组织变组织变脆脆 e.70%乙醇是乙醇是组织组织 的保存的保存剂剂 f.50%以上以上浓浓度的乙醇可以溶解脂肪及度的乙醇可以溶解脂肪及类类脂体脂体 醋酸醋酸； ；a.有刺激味的无色液体，温度低于有刺激味的无色液体，温度低于 15时结时结成冰状，故又称冰醋酸成冰状，故又称冰醋酸 b.常用常用浓浓度不大于度不大于 5%c.不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白 d.穿透穿透 力力强强，但易使，但易使组织组织膨膨胀胀 f.很少很少单单独用，都与其它固定独用，都与其它固定剂剂配合使用配合使用 丙丙酮酮； ；a.无色，易燃，易无色，易燃，易挥发挥发之液体之液体 b.能与水、乙醇等多种溶液混合能与水、乙醇等多种溶液混合 c.渗透力渗透力 强强， ，组织组织收收缩剧缩剧烈烈 d.广泛广泛应应用在用在组织组织化学中化学中酶酶的固定，免疫的固定，免疫组组化冰化冰冻冻切片的切片的 固定固定 中性甲中性甲醛醛液液：此液固定：此液固定组织组织效果效果较较好好 AF 液液;此液兼有脱水作用，此液兼有脱水作用， Bouin 液液:渗透力渗透力强强， ，对组织对组织收收缩缩小小 2.染色（染色（苏苏木素木素-伊伊红红染色，染色，简简称称 HE 染色）染色） 染色方法染色方法: a.切片脱蜡至水，入切片脱蜡至水，入苏苏木素液木素液 5 分分钟钟 b.水洗，分化，水洗，分化，蓝蓝化。化。 c.入伊入伊红红液数秒，水洗，脱水透明封固液数秒，水洗，脱水透明封固 d.结结果：果：细细胞核胞核蓝蓝色，其他色，其他红红色色 四、特殊染色四、特殊染色 一）、胶原一）、胶原纤维纤维染色：染色： 1.Van Gieson 染色（染色（苦味酸酸性复苦味酸酸性复红红法法 1889 年，年，简简称称 VG） ） 操作方法：石蜡切片脱蜡至水洗；操作方法：石蜡切片脱蜡至水洗；Weigert 铁苏铁苏木素木素 5min，水洗、分化、，水洗、分化、蓝蓝化、化、 DW 洗；加洗；加 VG 液液 15min， ，倾倾去染液，去染液，95%乙醇速洗；无水乙醇、二甲苯、乙醇速洗；无水乙醇、二甲苯、 中性中性树树胶封固。胶封固。 结结果：胶原果：胶原纤维红纤维红色、肌色、肌纤维纤维、胞、胞质质、 、红细红细胞黄色、核胞黄色、核蓝蓝褐色。褐色。 注意：注意：1.铁苏铁苏木素甲乙两液若木素甲乙两液若预预先混合，易氧化沉淀而失去染色能力。先混合，易氧化沉淀而失去染色能力。2.若胶若胶