研究生进修课程--临床病理学复习

病理复习 1.请结合自己的专业，简单设计一个免疫组织化学标记的方案来研究一个课 题.(一抗和二抗的名称和来源、一抗的定位预测；实验方案、生物学意义和临 床意义、实验设计（每个对照组的意义） 、结果判断。 一抗：STK15（Aurora-a）多克隆抗体（兔抗人） 二抗：二步法抗兔通用型免疫组化检测试剂盒 一抗的定位预测：表达在细胞浆中 实验方案：选择正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢恶性肿瘤组织三组石蜡标本切片。通 过抗体标记 STK15（Aurora-a） ，经过免疫组化染色后根据染色颗粒的强度与分布来判定 Aurora-a 在细胞浆中的表达结果。 生物学意义：Aurora-a 在人类多个肿瘤细胞系内被发现过度表达，是一种与中心体异常密 切相关的基因，其过度表达导致中心体过度复制，从而引起染色体分离异常，导致细胞分 裂阻滞，形成异倍体，引起抑癌基因的缺失或癌基因的获得或激活，从而引起细胞恶性转 化，促进肿瘤的发生。 临床意义：Aurora-a 的异常可能与恶性肿瘤的病理特点、临床分期、及预后有某些相关性。 它在早期肿瘤中均有阳性表达，表明 Aurora-a 蛋白水平的改变在卵巢癌中是常发事件，可 能代表了卵巢癌的早期病变，在卵巢癌的发病中起重要作用。抑制 Aurora-a 激酶的活性有 可能成为一个治疗肿瘤的有效手段。 实验设计：通过设立卵巢恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织的对照组，对比各组所 研究 Aurora-a 在不同组织中表达的差异，进而得出实验结论。 结果判断：采用 S-P 免疫组化染色后，利用电脑的病理图文报告分析系统进行结果判读， 对染色结果定量分析，记各组织片内肿瘤细胞 Aurora-a 蛋白的表达情况。 2. 免疫组化的应用范围：（1）提高病理诊断准确性 （2）对疾病的预后和治疗的意 义 （3）癌基因蛋白的应用 （4）对肿瘤增生程度的评价 ki67 PCNA （5）微小病 灶的发现 微小癌 微小病灶（如羊水栓塞） （6）在肿瘤分期上的意义 （7）指导肿 瘤治疗 （8）免疫性疾病的辅助诊断 （9）病原微生物的检测 3. ABC 复合物：ABC 法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性 质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化 HRP，然后与 卵白素按一定比例混合，形成 ABC 复合物。卵白素-生物素-过氧化物酶复合物。 4. 何谓抗原修复 组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原， 又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过 程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用 将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。 5.5. 掌握免疫组化在临床上应用的初步方案。A：已知的特异性抗体或抗原能特异性 结合。B： 通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、 同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 。C： 借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜 观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构。 6. “套餐式”免疫标记：免疫组织化学技术以抗原抗体反应为其理论基础，对肿瘤的 诊断和鉴别诊断有重要作用。目前常用抗体分为上皮性、间叶组织、神经及神经内分 泌、淋巴细胞标志物等四类。由于肿瘤类型极多，部分肿瘤的诊断和分型又极其困难， 因此诊断一些肿瘤的免疫组化方案必须是“套餐式”的，即每一种组织的标记物必须 用 2 种以上的抗体，除了能够阳性正面证实的抗体，还要有能阴性反面证实的抗体。 例如： a. Keratin,Vimentin,LCA,S100 四种抗体组合，Keratin 阳性且其它阴性的结 果可以筛选 出可疑癌或生殖细胞瘤；Vimentin 和 LCA 阳性的结果可以筛选出可疑淋巴瘤； Vimentin 和 S100 阳性的结果可以筛选出可疑神经内分泌肿瘤；Vimentin 阳性的结果可以 筛选出可疑肉瘤。 b. 在 Keratin 阳性的肿瘤中，CK17 和 CK18 阳性的结果提示移行细胞癌和某 些管状腺癌； CK17 阳性和 CK18 阴性的结果提示鳞癌、皮肤、鼻咽、食道癌等；CK17 阴性和 CK18 阳性的结果提示腺癌。 7.7. 分子病理学临床应用的进展，举例说明。 临床病理学的发展趋向：三段式诊 断：形态学诊断+免疫学标记+分子诊断。在经典病理学的基础上，采用现代辅助手段， 提高病理诊断率和预测(预后)率。临床分子病理学常用方法：免疫组织化学，基因克 隆性重排的检测，FISH 及 CGH，等位基因不平衡分析，杂合性缺失（LOH）的检测，微 卫星 DNA 不稳定性（MSI）的检测。I. TUNEL-免疫组化在细胞凋亡检测中的应用； 2.免疫组化多重标记的应用，临床上 IgH 和 TCR 基因单克隆检测在淋巴瘤的分子诊断 中普遍应用。当前分子病理学技术在临床的实际应用：肺癌的分子病理学（60%85% 的 NSCLC-腺癌细胞存在 EGFR 突变过表达，这部分患者接受肿瘤分子靶向治疗 （EGFR 抑制剂）的临床疗效优于常规化疗） ，胃肠道间质瘤(GIST) 的分子病理学（C- kit 突变是目前普遍认可的确定 GIST 的特异敏感指标） ，乳腺癌的分子病理学（30%的 浸润性乳腺癌和 70%的导管原位癌存在 Her-2 基因过表达。Her-2 阳性同时预示着肿瘤 对内分泌治疗和常规 CMF 方案相对耐药。注射用曲妥珠单抗(Herceptin)是第一个用于 治疗 Her-2 FISH 阳性乳腺癌患者的分子靶向药物。 ） ， 结直肠癌的分子病理学（对 K- ras 基因第二、三外显子（包括 12 号、13 号、61 号密码子）突变位点进行检测，为 结直肠癌患者提供准确可靠的用药指导。 ） ，恶性淋巴瘤的分子病理学（许多淋巴瘤治 疗相关的靶点、通路，也相应地研制出了许多针对相应靶点和通路的药物。 ） 8. 生物信息学 随着人类基因组计划的实施，通过基因组测序、蛋白质序列 和结构解析等实验，分子生物学家提供了大量的有关生物分子的原始数据， 需要利用现代计算技术对这些原始数据进行收集、整理、管理以便检索使 用，因而出现了生物信息学。生物信息学是多学科的交叉产物，涉及生物、数学、 物理、计算机科学、信息科学等多个领域。狭义的讲，生物信息学是对生物信息的获 取、存储、分析和解释；计算生物学则是指为实现上述目的而进行的相应算法和计算 机应用程序的开发。这两门学科之间没有严格的分界线，统称为生物信息学。 9. 结合自己专业，利用生物信息学，查找 XX（疾病+基因）在国内外的研究现 状。写出结论。 有关子宫颈腺癌与鳞状细胞癌中 TP53 基因突变的系统回顾 在多种人类癌症中可以见到肿瘤抑癌基因 TP53 突变。这项研究可提供不同地 理区域的子宫颈鳞状细胞癌和腺癌患者中 TP53 突变的详细分析。这一分析显 示 TP53 基因在子宫颈腺癌 （32/ 241 ； 13.3%）中有更高的突变率， 鳞状 细胞癌 (39/ 657 ； 5.9%；P = 0.0003）较腺癌突变率略低，有显著统计学意 义。在北美，腺癌的 TP53 突变比例为 4%，亚洲为 19%。TP53 基因的六个热点 密码子易发生突变，其中三个密码子 (175、 248 和 273)在两种类型的宫颈癌 中均为常见突变，密码子 (249) 主要在鳞状细胞癌中可见突变，密码子 (282) 只有在腺癌中可见突变。最常见的突变类型为 G 与 A 的转换及 C 与 T 的转换， 在鳞状细胞癌中占 48.7%，腺癌中占 53.5%。在腺癌中 25%的转换发生于 C 与 A 之间。鳞状细胞癌 中 14.6%的转换发生于 G 与 T 之间。从这个系统回顾中 可见看出，亚洲的子宫颈腺癌患者中可以见到 TP53 的高频率突变。需要进一步 研究 TP53 在宫颈癌中的定位以了解对癌症预后和结局突变的影响。 Tornesello ML, Buonaguro L, Buonaguro FM. Gynecol Oncol. 2013 Mar;128(3):442-8. doi: 10.1016/j.ygyno.2012.11.017. Epub 2012 Nov 17. Review. PMID:23168175 PubMed - indexed for MEDLINE TP53 在 OMIM 基因定位于 17p13.1 10.10.简述淋巴细胞克隆性重排的概念及其应用。 通常情况下，淋巴结、血液和骨 髓中每一个淋巴细胞基因型是不一样的。如果来自某一分化阶段的单个淋巴细胞发生 变异，同时失去正常的免疫监视，形成单克隆性增生，克隆性扩张的细胞基因型是一 致的，这就是淋巴瘤形成的遗传学基础，也是淋巴瘤分子病理学诊断的理论基础。当 前对肿瘤分子本质的共识：恶性肿瘤细胞克隆性增生。因此，检测肿瘤细胞的克隆性 存在，即可判断恶性肿瘤。克隆性重排检测 临床上 IgH 和 TCR 基因单克隆检测在淋 巴瘤的分子诊断中普遍应用。作为淋巴细胞源性肿瘤的分子生物学标记，是淋巴瘤早 期诊断和疗效评价的基本方法。 盲点：主要应用与淋巴细胞源性肿瘤的检测，其它 应用尚少，存在假阳性。 11.大肠癌分子分型的临床意义 A：分子医学视野下的结直肠癌:1近端远端结肠癌 各有遗传通道，2.远端结肠癌染色体 5q,17q 和 18q 等位基因缺失频率是近端结肠癌的 2 倍，3.近端结肠癌 MSI 频率是远端结肠癌的 10 倍，4结肠癌两大家族:FAP 和 HNPCC,前者好发于远端,与 CIN 有关;后者好发于近端,与 MSI 有关.，5.直肠癌基因突 变多于结肠癌，6.上端,中下端直肠癌预后不一。B：新发现导致了新的治疗模式的差异： 如：表皮生长因子受体(EGFR)靶向治疗，K-RAS 的靶向治疗。表皮生长因子受体 (EGFR)是原癌基因 C-erbB-1 的表达产物，EGFR 的过表达/突变在多种肿瘤的生长、发 展及预后中起关键作用，包括结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌及非小细胞肺癌等。抗 EGFR 的靶向药物西妥昔单抗（爱必妥）已成为治疗转移性结直肠癌的一线用药。K- ras 基因是细胞内信号传导通路中重要的“开关”，从而影响肿瘤的生长和扩散。K-ras 基因可以是正常状态（野生型）或异常状态（突变型） ，约有 35%结直肠癌患者为 K- ras 突变型。 K-ras 基因编码异常的蛋白，刺激促进恶性肿瘤细胞的生长和扩散，并 且不受上游 EGFR 的信号影响，所以对爱必妥治疗效果差。 晚期结直肠癌肝转移患者 的治疗显示，K-ras 野生型转移性结直肠癌患者一线接受西妥昔单抗+化疗治疗，客观 有效率达 59%，肿瘤进展风险下降 32%，疾病控制率在 90%左右，患者中位生存时间 达到 25 个月；而 K-ras 突变型患者无论采用标准剂量还是剂量递增方案治疗均无效。 进行 K-ras 基因检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗 EGFR 靶向治疗药物有效的结直肠癌患者，帮助医生选择对肿瘤病人最有效的治疗方法，从 而真正实现肿瘤病人的个体化治疗，还能大幅减少相关治疗费用和毒副作用。 12. 现代肿瘤分子病理发病机制 a. 细胞癌基因在正常细胞中未激活，又称为原癌基 因。原癌基因由于结构发生改变，而被 激活成为癌基因。原癌基因可发生结构改变 （突变）而变为癌基因；也可以是由于调节原癌基因表达的基因发生改变使原癌基因 过度表达，进而导致细胞生长刺激信号的过度或持续出现，使细胞发生转化。原癌基 因的结构改变包括点突变（如 90的胰腺癌有 ras 基因的点突变） 、染色体易位（如伯 基特淋巴瘤的 t(8：14)，慢性粒细胞白血病的 Phl 染色体） 、插入诱变、基因缺失和基 因扩增（如神经母细胞瘤的 Nmyc 原癌基因可复制成多达几百个拷贝，在细胞遗传 学上表现为染色体出现双微小体和均染区） 。癌基因编码的蛋白质（癌蛋白）与原癌基 因的正常产物有质或量的不同。癌蛋白调节其靶细胞的代谢、促使该细胞逐步转化， 成为肿瘤细胞。 b. 与原癌基因编码的蛋白质促进细胞生长相反，正常情况下细胞内 的肿瘤抑制基因的产物 能抑制细胞的生长。若其功能丧失则可能促进细胞的肿瘤性转 化。目前了解最多的两种肿瘤抑制基因是 Rb 基因和 P53 基因。它们的产物都是以转 录调节因子的方式控制细胞生长的核蛋白。肿瘤的发生可能是癌基因的激活与肿瘤抑 制基因的失活共同作用的结果。 c. 恶性肿瘤的发生是一个长期的、多因素造成的分 阶段的过程，这已由流行病学、遗传学 和化学致癌的动物模式所证明。单个基因的改 变不能造成细胞的完全恶性转化，而是需要多基因的改变。癌基因以及肿瘤抑制基因 的丧失或突变，这些阶段梯性积累起来的不同基因分子水平的改变，最终导致肿瘤发 生。 13.GIST 胃肠道间质肿瘤。胃肠道间质肿瘤已作为一种独立的肿瘤，以区别原诊断的 平滑肌或神经源性肿瘤，多数来源胃肠道 Cajal 间质细胞，命名为“胃肠道间质