细胞生物室操作规范

细胞生物室操作规范细胞生物室操作规范 细胞培养室是对各种动物组织细胞进行体外培养的实验室，具 有 良好的空气净化系统及多种大型精密仪器。为保证实验室的正常工 作秩序，请做到以下几点： 1.每天工作前打开换气扇及紫外灯半小时，确保无菌环境。 2.进入操作间要换洁净的白大衣、拖鞋，清洗双手。 3.操作间地面每周以新洁尔灭清洁两次。 4.CO2培养箱每月以 70%酒精清洁一次；注意 CO2浓度，及时更换 气瓶。 5.倒置、荧光显微镜及附设照相、图象采集分析系统的使用必须在 专管人员指导下，严格按操作规程进行。 6.培养的细胞要定期观察及时换液，做好记录，遇有污染，彻底消 毒。 7.操作完毕，认真清洁超净工作台。 8.离开实验室前关闭各水、电闸门。 2 各种培养用液的配制各种培养用液的配制 一、平衡盐溶液（BBS）的配制 Hanks 液 1、按成分表所示，准确称量试剂；许多试剂是含有水分的化合物，与不含水分 者的称量不同，应加以换算； 2、将 CaCl2 先溶解于 100ml 水中； 3、其它成分依次溶解于 750ml 水中（注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解 下一种成） ； 4、用数滴 5.6%的 NaCO3 溶液溶解酚红； 5、将 2 缓慢倒入 3 中，并不时搅动，防止出现沉淀； 6、将 4 加入 5 中； 7、将 6 入容量瓶中，补足水充分混均； 8、分装瓶中，8 磅 10 分钟高压蒸气灭菌，4冰箱保存。 二、培养液的制备 用干粉制备培养液的制备 1、制备出去离子水（玻璃三蒸水） ； 2、加温水至 15-30； 3、把干粉加入水中，搅拌令之溶解； 4、加 NaHCO3； 5、加水至最终量； 6、必要时用 1HCl 或 1N NaOH 调节 pH；因滤过时 pH 可能受影响； 7、用 0.22m 滤膜滤过消毒。 三、胰蛋白酶溶液的配制 (1)将 D-Han 液高压消灭菌，用 NaHCO3 液调节 PH 至 72 左右； (2)称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足 盐 溶液，搅拌混匀，量室温 4 小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡； 3 (3)次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常 用浓度为 0.25或 0.125%，胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调 PH 至 72 左右。 星形胶质细胞的原代培养星形胶质细胞的原代培养 一、药品和试剂 DMEM(Gibco) 培养基，添加 10%胎牛血清(Hyclone)、4mmol/L-谷氨酞胺 (Sigma)、10 万 U 青霉素、10 万 U 链霉素、15mmo/L HEPES(Sigma)； 0.25%、0.1%胰蛋白酶、75%酒精。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、 倒置相差显微镜、细胞培养瓶、75m 筛网、细胞计数器、吸管等。 三、实验对象 Wistar 大鼠(天津药物研究院提供) 四、操作步骤 1、出生后 2d 内 Wistar 大鼠(天津药物研究院提供)，无菌条件下断 头处死，取脑，投入 DHsnks 平衡盐溶液中，去除中脑、脑脊膜及大血 管皮层剪碎成 l 一 2mm3小块，吸管吹打 1min； 2、025胰蛋白酶消化 10min； 3、1500rmin 离心 10min，收集沉淀，DMEM 重悬； 4、75m 筛网过筛滤液 1500rmin 离心 10 min，收集沉淀，以培养液重悬， 调整细胞至 1106个/毫升。接种于 75cm3培养瓶、5%Co2，95%空气，37饱 和湿度培养。 5、4h 后换液，弃掉非贴壁细胞。 6、5d 后将培养瓶置于水平摇床，160 r/min，2h，37，换液弃除小胶质细胞， 恢复 1h 后重新置于水平摇床、160 r/min,18h,37,换液弃除少突胶质细胞。 8、2d 后以胰蛋白酶 0.1%,8min)消化、传代培养，待细胞长至近 80%融合时用于 实验。 4 脑皮层神经元的原代培养脑皮层神经元的原代培养 一、药品和试剂 DMEM(Gibco) 培养基，添加 15FCS(Hyclone)、4mmol/L。L谷氨酰胺、 10 万 U 青霉素、10 万 U 链霉素、15mmol/LHEPES；02胰蛋白酶 002EDTA、210-5mol/L 阿糖胞苷、75%酒精。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、解剖显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、 倒置相差显微镜、细胞培养板、75m 筛网、细胞计数器、吸管等。 三、实验动物：16d 龄 Wi star 大鼠 四、操作步骤 1、无菌条件下。取 16d 龄 Wi star 大鼠胚胎脑，置于含 7.5mmol/L 葡萄糖的 DMEM 中，解剖显微镜下去除嗅球、脑脊膜、海马和基底核、将皮质剪碎 成 1mm3小块； 2、吸除 DMEM，02胰蛋白酶002EDTA 消化 1min，10%FCS 终止消 化，1000 r/min 离心 10 min； 3、用培养液重悬沉淀,75m 筛网过筛，调整细胞密度至 1.0106个/毫升。接 种于预先涂有 0.005多聚赖氨酸(ployLlysine、Sigma)的培养板中、 5Co2、95空气。37、饱和湿度培养。 4、30 min 后换液，弃掉非贴壁细胞； 5、2d 后培养液中添加 210-5mol/L 阿糖胞苷(A rac、Sigma)。以抑制胶质细胞 生长。 6、以后每 3 天换液一半。神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色鉴定。 5 心脏微血管内皮细胞原代培养心脏微血管内皮细胞原代培养 一、药品和试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（型） 、0.1%胰蛋白酶 （1250） 、内皮细胞生长因子（ECGF） 、无钙、镁的 D-Hanks 液、青、链霉 素、75%酒精。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、 倒置相差显微镜、细胞培养瓶等。 三、实验对象 新生 46 天 Wistar 大鼠 四、操作步骤 1、取新生 46 天 Wistar 大鼠，浸泡于 75%酒精消毒 3min。 2、将鼠仰放于无菌平皿中，在无菌条件下迅速开胸取出心脏。 3、将心脏放于盛有 D-Hanks 缓冲液的平皿，冲洗心脏残余血液。 4、用眼科镊去除心脏顶部瓣膜、大血管及结缔组织等。 5、用眼科剪剪开左心室，将心脏组织放于另一盛有 D-Hanks 缓冲液的平皿。 6、收集心脏组织置于 75%酒精（去离子水配制）中浸泡 30s。 7、取出心脏组织于新的 D-Hanks 液冲洗。 8、收集组织于无菌平皿中剪碎呈肉糜状。 9、收集于三角锥中，加入等体积 0.2%胶原酶和 0.1%胰蛋白酶，于 37空气浴 振荡器中振摇消化。 10、10min 后收集上清液于离心管，1200 转/分离心 10min。 11、角锥中加入等体积 0.2%胶原酶和 0.1%胰蛋白酶，继续振摇消化。 12、心结束后，倾倒离心管上清液，加入含 1020%胎牛血清的 RPMI-1640 培 养液吹打，接种于 75cm2培养瓶中，于 37，5%CO2恒温培养箱中培养。 13、化 10min 后，吸取三角锥中上清液过 200 目网筛，收集于离心管，1200 转/ 分离心 10min。 14、重复步骤 12。 15、利用上一次离心后的上清液，加入三角锥继续振摇消化。 16、重复步骤 1315 约 23 次。最后一次去除步骤 15。 6 17、2h 后，去除各培养瓶内未粘附的细胞，换含 10mg/L ECGF 的 RPMI 1640 完全培养液，于 37，5%CO2恒温培养箱中培养。 心肌细胞原代培养心肌细胞原代培养 一、药品和试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清、0.2%胶原酶（型） 、0.1%胰蛋白酶 （1250） 、5-溴脱氧尿苷（Brdu） 、无钙、镁的 D-Hanks 液、青、链霉素、75%酒 精。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、超净台、医用离心机、空气浴振荡器、5%CO2恒温培养箱、 倒置相差显微镜、细胞培养瓶等。 三、实验对象 新生 46 天 Wistar 大鼠 四、操作步骤 1. 步骤 116 同心脏微血管内皮细胞原代培养的操作。 2. 2h 后，收集未贴壁的心肌细胞重新悬于含 1020%胎牛血清 1640 培养液 中，接种于 75cm2培养瓶中，于 37，5%CO2恒温培养箱中培养。 3. 前 3d 加用 0.1mmol/L Brdu 以抑制非心肌细胞生长，直至心肌细胞铺满 瓶底即可传代。 4. 将最后一次消化剩余的心脏组织收集入 75cm2培养瓶，加入含 1020% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液，于 37，5%CO2恒温培养箱中培养。 缺氧损伤模型的制作缺氧损伤模型的制作 一、主要仪器 缺氧装置、5%CO2恒温培养箱。 二、操作步骤 1. 将细胞标本放于缺氧装置 B 罐内，关紧门。 2. 依次打开真空泵开关、真空泵阀门、B 罐开关。 3. 当真空压力指针超过 600mm Hg，依次关闭真空泵阀门、真空泵开 关。 4. 依次打开输气阀开关、氮气罐开关。 5. 当真空压力指针归零，依次关闭输气阀开关、氮气罐开关。 7 6. 依次打开真空泵开关、真空泵阀门。 7. 重复步骤 35 一次。 8. 重复步骤 6、34，当真空压力指针归零，依次关闭 B 罐开关、输气 阀开关、氮气罐开关。 9. 3h 后，取出细胞标本，于 37，5%CO2恒温培养箱中培养 1h。 动脉平滑肌细胞动脉平滑肌细胞原代培养原代培养 一、药品和试剂 D-Hanks 液 L15 平衡液、胰蛋白酶 (GIBCO 公司)；DMEM(Gibco 公司产 品)、胎牛血清(FCS，Hyclone 公司)；Hepes； 75%乙醇。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、小烧杯、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置 相差显微镜、25cm2培养瓶、离心管等。 三、实验对象 Wistar 大鼠,雌性,体重 150g 左右。 四、操作步骤 1、将 Wistar 大鼠在严格的无菌条件下,取出胸腹主动脉,放入 D-Hanks 液中,剥 离外膜,剪开动脉,用刀片轻巧地刮除内膜,在盛有 D-Hanks 液的小烧杯中剪成约 1mm3大小的小块； 2、吸除 D-Hanks 液,转入 25cm2的培养瓶中,在 37。C5%CO2孵箱中帖壁 1 小时, 加入含 20%特优胎牛血清(Hyclone 公司产品)的 DMEM(Gibco 公司产品,加入 25mM Hepes,青霉素 100IU/ml,链霉素 100IU/ml). 3、在第 7-8 天细胞已自组织块边缘处长出后,去除组织块并首次换液,以后每 3 天换一次液. 4、待细胞生长至接近融合时开始传代,倒去含血清的 DMEM,D-Hanks 液洗 2 次, 0.25%胰酶 1ml 消化 5-10 分钟，在倒置相差显微镜下观察见胞质回缩,细胞间隙 增大后,加入含血清的 DMEM 终止消化,吹打细胞制成细胞悬液,倒入离心管,800- 1000 转/分钟离心 10 分钟,倾去上清,以含 10%胎牛血清的 DMEM 制成细胞悬液， 分别接种于 3 个 25cm2培养瓶中. 5、鉴定:抗 actin 染色(SP 法):将细胞悬液接种于放有盖玻片的 6 孔培养板中, 待细胞贴壁生长 2-3 天后,倒去培养液,TBS(0.05M,pH7.6)洗 5 分钟*3 次,4。C 预冷丙酮固定 10 分钟，TBS 洗 5 分钟*3 次，加封闭血清，37。C 孵育 30 分钟， 8 TBS 洗 5 分钟*3 次，加一抗，抗体浓度 1:100, 4。C 下过夜,TBS 洗 5 分钟*3 次,加 二抗(生物素标记兔抗山羊 Ig), 37。C 孵育 30 分钟,TBS 洗 5 分钟*3 次,加三抗 (辣根酶标记链霉卵白素工作液), 37。C 孵育 30 分钟,TBS 洗 5 分钟*3 次,滴加 DAB-H2O2显色,常规脱水,透明封片. 肾小球系膜细胞培养肾小球系膜细胞培养 一、药品和试剂 IV 型胶原酶、胰蛋白酶、 （Sigma 公司产品） 、RPMI-1640（GIBCO 公司产 品） 、特等优级胎牛血清（FCS，Hyclone 公司产品） 。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、倒置显微镜、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、 培养瓶及培养板（Costar 公司产品） 二、实验对象 远交系健康雄性 Wistar 大鼠，体重 150200g，共 12 只，由国家医药管理 局药物研究院实验动物室提供。 四、操作步骤 1.将大鼠处死，无菌取出双肾，取皮质，将其剪碎，依次经过 140 目、80 目、 200 目过筛，在 200 目下收集肾小球细胞。 2. 将提取的肾小球细胞，用无菌的 1640 培养液洗一次，离心，加入 0.15%的 IV 胶原酶消化，37水浴 8 分钟，1000r/min,离心 7 分钟。 3. 用 20%FBS1640 培养液悬浮细胞，分装于培养瓶 ，放入 CO2孵箱，第 6-7 天 首次换液，以后每 2-3 天换液一次，待，系膜细胞布满瓶底，进行传代。 9 雪旺氏细胞原代培养雪旺氏细胞原代培养 一、药品和试剂 L15 平衡液、胰蛋白酶和胶原酶(GIBCO 公司)；DMEM 培养液、胎牛血 清(FCS，Hyclone 公司)； 75%乙醇。 二、仪器设备与材料 无菌手术器械、超净台、医用离心机、5%CO2恒温培养箱、倒置相差显微 镜、35 细胞培养皿、离心管等。 三、实验对象 新生 46 天 Wistar 大鼠 四、操作步骤 1、取新生 46 天 Wistar 大鼠脱臼处死，乙醇消毒，在无菌条件下取双侧坐骨 神经，置 L15 平衡液中。 2、解剖显微镜下仔细去神经外膜，反复冲洗几次后，用眼科剪将其剪成 2mm3 大小的碎块，37下用 0.25%胰蛋白酶和 0.125%胶原酶混合液消化 20 分钟， 加少量小牛血清以终止反应； 3、消化后用吸管反复吹打。以分散 Schwaun 细胞，细胞在 DMEM10FC5 培养液中培养。 4、每日观察细胞生长状况，1 周换液 2 次。 10 软骨细胞分离及体外培养软骨细胞分离及体外培养 一、药品和试剂 胰蛋白酶，II 型胶元酶，DMEM 培养基，Gibco；青霉素，链霉素， Sigma；N-(2-羟乙基)哌嗪 N-2-乙磺酸(HEPES)，Boehringer；抗坏血酸；谷氨 酰胺，Merck；L-脯氨酸，上海政翔化学试剂研究室；维生素 C 注射液，齐齐 哈尔第二制药厂；胎牛血清，TBD 生物技术发展中心。 培养液：DMEM 培养基中加入 4.5 g/L 葡萄糖，584mg/L 谷氨酰胺，15% 胎牛血清，50u/ml 青霉素，50g/ml 链霉素，10mM HEPES，0.4 mM 脯氨酸与 50g/ml 抗坏血酸，过滤除菌 二、仪器设备与材料 超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；CO2培养箱，美国；恒温磁力搅拌 器，81-2 型，上海司乐仪器厂；离心机，北京医用离心机厂；倒置显微镜，光 学显微镜，Nikon；血细胞计数板，上海；24 孔培养板，48 孔培养板，Costar， 美国；玻璃培养瓶、培养皿、盖玻片、烧杯、试管、漏斗若干；手术刀，止血 钳，眼科齿镊，眼科剪刀若干 三、实验对象 新生 46 天 Wistar 大鼠 四、操作步骤 （一）牛软骨细胞消化分离 1、从本地屠宰场获取 4 小时内宰杀的成年牛膝关节，用 0.9%NaCl 溶液湿润的 无菌纱布包裹严密，携至实验室。 2、在超净工作台上进行无菌操作，将股骨远端关节面用含有 50u/ml 青霉素， 50g/ml 链霉素的 PBS 溶液清洗干净，用手术刀切取 1mm 厚的牛关节软骨 薄片，将其浸入 PBS 溶液中，剪切成 1mm3大小的小块，从同一头牛两个膝 11 关节可获得软骨小块约 3cm3。 3、用 PBS 溶液冲洗 3 次，置于 50ml 烧杯中，加入 20ml 的 0.25%胰蛋白酶溶 液和 1cm 长的磁力搅拌棒，用 150ml 烧杯和直径 10cm 的培养皿将其上下盖 严，放在 37恒温培养箱内的磁力搅拌器托盘上，以 60rpm 搅拌消化 30min。 4、去掉胰蛋白酶溶液，将软骨小块用 PBS 溶液冲洗 3 次，加入 15ml 的 0.2%II 型胶原酶溶液，用与胰蛋白酶消化过程同样的温度和搅拌条件消化 4h，分 离软骨细胞。 5、消化结束后，使细胞悬液通过孔径 45m 的尼龙网滤器，滤去未消化的组织 残渣，过滤后的细胞悬液以 1000 rpm 转速离心 10min 分离细胞，弃去消化 液。用配制好的 DMEM 培养液洗涤细胞，1000 rpm 转速离心 7min 后弃去 培养液，如此反复三次，可得到较为纯净的牛软骨细胞。 6、将细胞悬浮于 5ml 含有 4.5 g/L 葡萄糖，584mg/L 谷酰胺，15%胎牛血清， 50u/ml 青霉素，50g/ml 链霉素，10mM HEPES，0.4 mM 脯氨酸与 50g/ml 抗坏血酸的 DMEM 培养基中，制成细胞悬液，备用。用血细胞计数板计数， 从一头牛的一个膝关节股骨远端收获细胞数约为 4.9107。 （二） 骨细胞消化分离 取 4 周龄新西兰种幼兔，处死后手术取出膝关节，然后在超净工作台上进 行无菌操作，将股骨远端与胫骨近端关节面用含有 50u/ml 青霉素，50g/ml 链 霉素的 PBS 溶液清洗干净，用手术刀切取 1mm 厚的牛关节软骨薄片，将其浸 入 PBS 溶液中，剪切成 1mm3大小的小块，以后的操作与 2.2.2.1 中方法相同。 从同一只家兔两个膝关节可收获细胞数约为 2.1107。 （三） 软骨细胞与兔软骨细胞体外培养及传代 1、按以上方法制得细胞悬液，用培养液稀释至 1-2105细胞/ml，分别接种到 25cm2培养瓶中，每瓶约 4ml，塞严胶塞，置于 37含 5CO2培养箱中恒温培 养。培养三天后更换培养液，此后 3 天换液一次。每天定时在倒置显微镜下观 察，并照像记录。 2、当细胞贴壁生长，分泌基质，互相连接成单层时，即可进行传代培养。首先 弃去原培养瓶内的培养液，向 25cm2培养瓶内加入 0.25胰蛋白酶液 4ml，置 37培养箱内 20min。 12 3、镜下观察细胞相互分离，间隙变大，细胞趋于变圆，部分呈游离态时，小心 倒出胰蛋白酶液，然后加入培养液，用吸管轻轻吹打，将细胞悬浮于培养液内， 再分瓶培养。 4、瓶后的细胞即为第一代，培养方法与原代培养相同。此后，按同样方法可再 进行传代培养，依次得到第二代、第三代及第四代体外培养的软骨细胞，定时 在倒置显微镜下观察，并记录。 （四） 、体外培养软骨细胞的组织化学鉴定 1、标本制备 将盖玻片裁成 88mm 见方的小块，清洗、灭菌后置于 24 孔培养板的培 养孔内。每孔加入 0.2ml 浓度为 9.8105细胞/ml 的细胞悬液，再加入培养液 0.5ml，盖上盖子，置于 37含 5CO2培养箱中恒温培养。培养三天后更换培 养液，此后 3 天换液一次。 2、组织化学染色 将不同种类、不同培养时间、不同代的软骨细胞标本从培养液中取出，用 PBS 溶液冲洗 2 次，以梯度乙醇溶液逐级脱水，然后用 1茜素红、1美蓝染 液染色观察软骨细胞，2甲苯胺蓝染液染色观察细胞外基质。 细胞冰冻与复苏细胞冰冻与复苏 1.取对数生长期的细胞，以胰蛋白酶与 EDTA 混合液消化分散（悬浮细胞除外） ， 以培养液稀释。 2.取适量细胞计数，并使成为 2.5106个细胞/ml 冻存液。冻存液的成分为： RPMI-1640 80%;DMSO 10%;小牛血清 10% 3.将一毫升细胞悬液分装于安瓿中，封口，标记。 4.将安瓿置 4 冰箱数小时，再移至-40-60冰箱 12-24 小时，然后立即投 入液氮中。 13 5.复苏细胞时，将安瓿迅速投入 38-40水浴中，并充分摇动，使其迅速融化。 6.将细胞移入离心管，1000r/min 离心 5 分钟，弃上清，加入培养液，置温箱培 养。 总总 RNA 抽提抽提 1、细胞裂解或组织匀浆。 a.贴壁细胞 吸尽培养液，每 10 平方厘米细胞加入 1ml Beyozol。一般六孔板每孔加 1ml，12 孔板每孔加 0.5ml。晃动 3-5 下，再用枪吹打 2-3 下，确保全部裂解， 然后吸至离心管中。 b.悬浮细胞 离心收集细胞，吸尽液体，每五百万至一千万动植物或酵母细胞，或一千 万细菌，加入 1ml Beyozol。用枪吹打或适当 vortex，确保全部裂解。某些酵母 和细菌如裂解不充分，可用匀浆器匀浆，确保全部裂解。 c.组织 先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每 50mg-80mg 组织加入 1ml Beyozol，匀浆。 2、对于某些蛋白，多糖或脂含量很高的细胞或组织，Beyozol 裂解后可能会有 不溶物或油脂状漂浮物。需 12,000g 4离心 10 分钟，然后吸取澄清的 Beyozol 裂解产物至一新的离心管中。 3、室温放置 5 分钟，使样品充分裂解。 4、每毫升 Beyozol 加入 0.2ml 氯仿，vortex 混匀或猛烈晃动 15 秒，室温放置 2- 3 分钟。 5、12,000g 4离心 15 分钟，然后吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管 14 中，每毫升 Beyozol 约可吸取 0.5-0.55ml。 6、按每毫升最初的 Beyozol 加入 0.5ml 异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀 10 分钟。 7、12,000g 4离心 10 分钟，在管底可见胶状 RNA 沉淀，弃上清。8、每毫 升最初的 Beyozol 加入 1ml75%乙醇，vortex 或颠倒混匀， 9、7,500g 4离心 5 分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm, 离心 1 秒） ，小心吸尽液体。 10、 待 RNA 略干后，加入 20ml DEPC 水溶解，-70冻存。注意，切勿让 RNA 过分干燥，否则将极难溶解，且测出的 A260/280 值会低于 1.6。 注意事项： 1、有离心管，枪头及相关溶液都必需无RNA酶污染。耐高温器物可150烘烤4小 时以除去RNA酶，其它器物除RNA酶可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜， 然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%（体积比） diethylpyrocarbonate（DEPC）至重蒸水或MiliQ级水中，处理过夜，灭菌即 成DEPC水。 2、必需戴一次性手套操作，且尽量不要对着RNA样品呼气或说话，以防RNA 酶污染。 3、 Beyozol含有毒物质苯酚，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防 护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触Beyozol，请立即用大量去垢剂和水 冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。 15 PCR 实验操作规范实验操作规范 由于 PCR 实验技术要求高，影响因素很多，因此要想得到较好的实验结果， 应注意以下几个问题。 1、标本模板的处理标本模板的处理 单、双链 DNA 或 RNA 都可以进行 PCR，但临床检测标本往往是粗提 物， 此对标本的要求不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA 聚合酶抑制剂， 以及能结合 DNA 的蛋白质，如果在标本处理完全的情况下，扩增带不理 想，则要考虑核酸解链是否完全。有时还可以考虑用 Sephadex C-50 柱处 理标本，得到满意的结果。 2、引物引物 引物的设计与合成纯化是 PCR 特异性反应的根本所在，若引物的纯度 低（提纯及降解因素） ，实验结果就无法解释。 3、试剂的均匀性试剂的均匀性 保证试剂的溶解均匀性，打开使