猪链球菌的检测课件

猪链球菌的检测 九江市疾病预防控制中心 梁剑锋 2011年8月15日 一、病原学 二、发病机制 三、流行病学 四、临床表现 五、预防与控制 六、病原学鉴定 七、鉴别诊断 人感染猪链球菌病是由猪链球菌（streptococcus suis） 感染人而引起的人畜共患性疾病。从事猪的屠宰及加工等 人员为高危人群，本病主要通过皮肤的伤口而感染。临床 表现为发热、寒战、头痛、食欲下降等一般细菌感染症状 ，重症患者可合并中毒性休克综合征（toxic shock syndrome, TSS）和链球菌脑膜炎综合征（streptococcus meningitis syndrome, SMS）。 1968年丹麦学者首次报道了3例人感染猪链球菌导致脑膜炎并发败血 症病例，1975年荷兰也出现了散发病例的报道。此后，中国香港、英 国、加拿大、德国、法国、美国、澳大利亚、比利时、巴西、西班牙 、日本、泰国、瑞典及中国内地陆续有人感染猪链球菌病的报道。截 至2000年，全球已报道了200多例人感染猪链球菌病病例，报道病例 较多的国家或地区普遍养殖业发达或有食用猪肉的习惯，病例呈高度 散发态势。在我国，1998年江苏省报告了人感染猪链球菌病，发病25 例，死亡14例；2005年6月至8月，四川省发生的人感染猪链球菌病爆 发疫情，为国内外迄今为止见于报道的最大规模人感染猪链球菌病疫 情，发病数204例，死亡38例。 链球菌分类： 1、根据溶血现象分类 1）甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中 的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。 2）乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血，溶血环中 的红细胞完全溶解，致病力强。 3）丙型链球菌：无溶血环，一般不致病。 猪链球菌溶血(偶而也有弱溶血或溶血、溶血现 象均不明显 ) ，某些菌株在马血培养基上溶血。 链球菌分类： 根据抗原结构的分类 兰氏分类：按多糖类抗原（C抗原）将链球菌分成A、B、C 、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其 中缺I、J群) ，近年又增加U、V群，共20群，每个群有1 个或多个种。 一、病原学 猪链球菌属链球菌（streptococcus）科，革兰染色阳性 ，呈球形或卵圆形。链球菌科有30个以上的菌属，分类有 数种方法，根据链球菌兰斯菲尔德（Lancefield）分类法 ，将猪链球菌分到了R、S、T群。近年根据细菌荚膜多糖 抗原的差异，将猪链球菌分为35个血清型，即134型和 1/2型，其中1/2型为同时含有1型和2型抗原的菌株。2型 猪链球菌主要是R群，而1型猪链球菌主要是S群。 迄今为止，文献报道感染人的猪链球菌分别是2型、1型和 14型，尤以2型为常见，也是最常被分离到的猪链球菌型 别，其他两个型别仅有个案报道。 1、猪链球菌的理化特性 该菌无芽胞，有荚膜，在血平板上生长呈细小菌落，无色 ，半透明，直径0.51 mm，边缘整齐，凸起，光滑。根 据溶血情况分类，猪链球菌在羊血平皿上表现为溶血， 而在马血平皿上表现为溶血。适宜的培养基为血培养瓶 及血平皿，培养温度36 、时间1820小时。新分离的 猪链球菌，形态较典型，链长可达20多个菌体；二代培养 后细菌形态不典型,甚至变为革兰阴性球杆菌,不成链。因 此在诊断、研究时，对刚分离到的细菌形态进行观察十分 重要。猪链球菌对环境理化因素的抵抗力差，对常见消毒 剂都敏感。 2、毒力因子 目前认为，较为重要的猪链球菌毒力因子主要有： 1）荚膜多糖（CPS）：是目前惟一被确认的，也是最为重 要的毒力因子。 2）溶菌酶释放相关蛋白（muramidase-released protein, MRP）和细胞外蛋白因子（extracellular factor, EF）：除荚膜多糖外，这两种蛋白是最常用于评 价猪链球菌毒力的指标。 3）猪链球菌溶血素（suilysin）：溶血素被认为是几种 细菌的主要毒力因子，可能在猪链球菌侵入和裂解细胞的 过程中发挥着重要作用。 4）44000蛋白、IgG结合蛋白及其他因素：44000蛋白为2 型猪链球菌的胞壁蛋白，IgG结合蛋白属热休克蛋白，有 报道认为也与毒力相关。菌毛(fimbriae)、黏附因子 (adhesions)也是一些细菌常见的毒力因子。 3、MLST分析 对我国江苏和四川省人感染猪链球菌病爆发期间分离到的 菌株，进行多位点序列分型（multilocus sequence typing ,MLST），证实均为序列7型（MLST 7型）。 二、发病机制 猪链球菌感染的主要传播途径是经伤口的直接接触感染。 猪链球菌经皮肤或黏膜的伤口进入人体，进入血液循环后 在血液中迅速生长和繁殖，即败血症，细菌随血液循环进 入人体的各器官、组织，致多器官、组织发生病变。细菌 并释放毒素，致机体发生严重的中毒反应，即毒血症。重 症感染及细菌毒素的作用，致血管内皮损伤，以及血液处 于高凝状态，并发弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)，导致全身性微循环 障碍，多器官功能衰竭。 人感染猪链球菌临床主要有两种严重表现形式，即SMS和 TSS。SMS的主要病理表现是化脓性脑膜炎，脑膜血管充血 明显，并有大量中性粒细胞浸润，而其他脏器的病理改变 轻微。 TSS的特征是败血症休克合并DIC，病理表现为全身多器官 、组织实质细胞变性和坏死，以及不等量的中性粒细胞浸 润，间质内血管明显充血、漏出性出血，毛细血管内微血 栓（透明血栓）形成。主要受累器官的表现为： 皮肤、黏膜（胃肠道、呼吸道及泌尿生殖道）与浆膜出 现瘀点和瘀斑；心、肝、肾、肾上腺、食管和肠道等脏器 出血，血液不凝固，颜色鲜红；部分器官（肺、肾）毛细 血管内有数量不等的微血栓（透明血栓）形成，后者呈 PTAH染色阳性，支持为纤维蛋白性血栓。 肺充血、水肿，灶性和片状出血，以及毛细血管内微血 栓形成。 急性脾炎。 肝脏轻度肿大，肝细胞点状、灶性或片状坏死。 肾脏充血、出血，肾小球毛细血管内数量不等的微血栓 形成。 心肌纤维变性、点状坏死及炎细胞浸润，间质血管充血 伴多灶性出血。 浆膜腔积液，如胸腔、心包腔和腹腔积液等。病变以肺 、肾脏和心脏为甚，而脑和脑膜的病变不明显。有的病 例可见皮肤有伤口，常见于手臂与足等处。 重症猪链球菌感染者可合并DIC。病理表现为全身多器官 、组织内毛细血管漏出性出血，血液不凝固，继而导致多 器官功能衰竭和休克。 休克是强烈的致病因子作用于机体引起的全身危重病理过 程，多种原因可致休克。重症人感染猪链球菌病患者发生 休克应是多种原因所致，包括某些炎性介质的作用引起 静脉和毛细血管扩张，致血管总容积增加；DIC致广泛 性毛细血管漏出性出血使血容量减少；心肌病变致心输 出量减少等。 SMS患者，因脑脊髓膜血管高度扩张充血，蛛网膜下腔增 宽，大量中性粒细胞、纤维蛋白及液体渗出导致脑脊液量 增加，而引起颅内高压，患者可有头痛、喷射状呕吐以及 病理征阳性等症状和体征。因颅神经受累，患者可有不同 程度的听力障碍，甚至永久性耳聋。 三、流行病学 1、传染源 感染猪链球菌的病（死）猪是人感染猪链球菌病的主要 源头。另有文献报道，一些病死的鹿、羊、鸡、鸭、马、 猫、狗及反刍动物体内能分离到2型猪链球菌，但这些动 物是否为传染源尚待进一步研究。 目前尚无证据表明人感染猪链球菌病能在人与人间传播。 2、传播途径 人感染猪链球菌主要因接触被猪链球菌感染的生猪和未 加工的猪肉制品，经皮肤破损的伤口或眼结膜而感染。是 否能通过呼吸道，借助气溶胶由病猪而感染人仍有待深入 研究。 3、人群易感性 人群普遍易感。直接接触感染的病（死）猪或猪肉制品 的人群为高危人群，有皮肤破损者极易发病。国外多数学 者认为人感染猪链球菌病是人类一种重要的动物源性职业 病。免疫功能缺陷的人群感染猪链球菌，往往病症较重。 4、流行特征 本病的流行特征还不完全清楚，人感染猪链球菌病常伴 随猪群中链球菌病的爆发而高度散发，已报道的人感染猪 链球菌病例常发生于夏季。猪间猪链球菌感染的扩散可能 与高温潮湿的环境密切相关，因此高温潮湿也很可能是间 接导致人感染猪链球菌病夏季发病增加的因素。人感染猪 链球菌病与性别、年龄没有必然联系，但与职业有很大关 系，从事猪的养殖或者是参与猪的屠宰、加工、配送、销 售及烹调的人员均属高危人群，尤其是宰杀病（死）猪者 危险性更大。 四、临床表现 潜伏期数小时7天，一般为23天。潜伏期长短与感染 病原体的毒力、数量以及机体免疫力等因素有关。一般来 说，潜伏期越短，病情越重。 1、临床症状和体征 急性起病，轻重不一,表现多样。 1）感染中毒症状：高热、畏寒、寒战，伴头痛、头晕、 全身不适、乏力等。 2）消化道症状：食欲下降、恶心、呕吐，少数患者出现 腹痛、腹泻。 3）皮疹：皮肤出现瘀点、瘀斑，部分病例可出现口唇疱 疹。 4）休克：血压下降，末梢循环障碍。 5）中枢神经系统感染表现：脑膜刺激征阳性，重者可出 现昏迷。 6）呼吸系统表现：部分严重患者继发急性呼吸窘迫综合 征（ARDS），出现呼吸衰竭表现。 7）听力、视力改变：听力下降，视力下降，且恢复较慢 。 8）其他：少数患者可出现关节炎、化脓性咽炎、化脓性 淋巴结炎等，严重患者还可出现肝脏、肾脏等重要脏器的 功能损害。 2、临床分型 根据临床表现的不同，可以分为以下类型。 1）普通型：起病较急，发热、畏寒、头痛、头晕、全身 不适、乏力，部分患者有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等表现 ，无休克、昏迷表现。 2）休克型： 在全身感染基础上出现血压下降，成人收缩 压低于90 mmHg（1 mmHg0.133 kPa），脉压小于20 mmHg，伴有下列两项或两项以上：肾功能不全；凝血 功能障碍，或弥散性血管内凝血；肝功能不全；急性 呼吸窘迫综合征；全身皮肤黏膜瘀点、瘀斑，或眼结膜 充血；软组织坏死，筋膜炎，肌炎，坏疽等。 3脑膜炎型：发热、畏寒、全身不适、乏力、头痛、呕 吐。重者出现昏迷。脑膜刺激征阳性，脑脊液呈化脓性改 变。 4混合型：兼有休克型和脑膜炎型表现。 五、预防与控制 人感染猪链球菌病的预防控制应以疫情监测、严格控制传 染源、切断传播途径等综合性防治措施为主。 1、疫情监测 各级各类医疗机构，尤其在已经发生动物疫情和曾经发生 人感染猪链球菌病疫情的地区及周边地区，要开展对不明 原因发热病例的监测。接诊可疑不明原因发热患者必须询 问流行病史，如发现有病（死）猪接触史，应在积极治疗 的同时，立即向当地疾病预防控制机构报告。 2、管理传染源 应在当地有关部门的指导下，对病（死）家畜进行消毒、 焚烧、深埋等无害化处理。严禁屠宰、加工、贩卖病（死 ）家畜及其制品。 3、切断传播途径 1）对直接接触（如宰杀、洗切加工、搬运等）感染的病 （死）猪或猪肉制品的人员，开展为期1周的医学观察， 主要观察体温变化，一旦出现发热应立即就诊。 2）做好疫点的消毒处理。对患者家庭及其畜圈、禽舍等 区域和患者发病前接触的病（死）猪所在家庭及其畜圈、 禽舍等疫点区域进行消毒处理。 患者的排泄物、分泌物、呕吐物等应用消毒液消毒。 3）根据实际情况，划定疫点、疫区、受威胁区，必要时 采取一定管制措施。 4、保护易感人群 1）个人防护 动物疫情发生地的生猪屠宰、加工、销售等从业人员或其 他相关人员应做好个人防护工作，特别是从事动物疫情处 理的工作人员应采取严格的个人防护措施。 从事人感染猪链球菌病例调查、采样、临床救治、实验室 检测和消毒工作的医务卫生人员均应采取严格的个人防护 措施，严防发生感染。 2）药物预防 对直接接触感染的病（死）猪或猪肉制品的人员可用阿莫 西林进行预防性服药，每次0.5 g，每天3次，连服3天。 3）健康教育 采取多种形式开展健康宣传教育，向群众宣传传染病和人 畜共患病防治知识，告知群众不要宰杀、加工、销售、食 用病（死）家畜。 5、流行病学调查 发现人感染猪链球菌病疫情后，疫情发生地县级疾病预防 控制机构要立即组织开展流行病学调查，在最短时间内对 所报告病例进行核实，进行个案调查。 六、病原学鉴定 猪链球菌的实验室检测主要是对细菌培养所获得的菌株分 离后进行生化鉴定、血清分型以及特异性基因检测。目前 尚无成熟的特异性抗体检测方法。 1标本采集及病原体分离 采集患者的血液、脑脊液或尸检标本，直接接种于猪链球 菌最佳培养基进行培养分离。如条件所限，不能立即接种 ，应4保存或冷藏送检，争取及时培养。 1）样品采集 对病猪，最急性和急性病例可无菌采集死亡猪的心、肝、 肺、肾、脾脏、淋巴结等组织，慢性病例如关节炎型一般 采取关节液及周围组织；对活猪可采取扁桃体拭子、鼻腔 拭子。 2）分离培养 送检菌株的分离 划线接种于普通琼脂绵羊血平板，361培养 24h2h，如茵落生长缓慢，可延长至48 h2h，使之形 成单个菌落，以供鉴定用。 病料的分离和触片检查 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线 接种于普通琼脂绵羊血平板，于361培养24 h2h ，如菌落生长缓慢，可延长至48 h2h后观察。同时取病 料做组织触片，姬姆萨染色（按GB/T 4789. 28的方法进 行染色）后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌 。 扁桃体和鼻腔拭子的分离 扁桃体和鼻腔拭子样品加入到含有S mL灭菌的选择性THB 增菌液的试管中，于361培养24 h2 h后，划线接种 于选择性普通琼脂绵羊血平板。 动物产品的均质、增菌和分离 以无菌操作取检样25g，加入装有225 mL灭菌选择性THB 增菌液的广口瓶内，均质，于361培养24 h2h后， 划线接种于选择性普通琼脂绵羊血平板。 3）初步鉴定 猪链球菌2型在36培养24 h后，在普通琼脂绵羊血平板 和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、表面光 滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3 mm-l mm，大多数菌株呈溶血，部分菌株产生溶血。将可疑菌 落做革兰氏染色和过氧化氢酶试验。本菌为革兰氏阳性球 菌，菌体直径约1m，固体培养物以双球菌为多，少量呈 3个-5个排列的短链，液体培养物以链状为主，无芽孢， 能形成荚膜（按GB/T 4789. 28的方法进行染色）。本菌 过氧化氢酶试验均为阴性。 菌落生长特征、革兰氏染色 、菌体形态和过氧化氢酶试验符合者，可初步确定为链球 菌。 革兰染色镜下成对出现，革兰氏阳性链球菌 猪链球菌显微镜形态 猪链球菌鲜血琼脂培养菌落形态 羊血平皿：溶血 2生化鉴定 对分离到的菌株应用API生化鉴定系统的Api20-step手工 鉴定条及Vitek-compact2或其他生化鉴定系统进行鉴定， 可直接鉴定到种。 经初步鉴定后，做5%乳糖、海藻糖、七叶苷、甘露醇、山 梨醇、马尿酸钠等糖发酵试验。猪链球菌2型发酵5%乳糖 和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露醇和山梨醇，不 水解马尿酸钠。 3血清分型 对经过生化鉴定的菌株用猪链球菌134型血清或用单克 隆抗体进行分型。实验方法：取1滴链球菌分型血清或单 克隆抗体悬滴于载玻片上，与1滴菌悬液充分混合，或用 接种环刮取单个菌落直接与血清混合，观察是否出现凝集 反应，同时用生理盐水做对照。 将可疑菌落接种THB肉汤（见第B3章），于361c培 养18 h2h，取1.5 mL培养物，10 000 r/min离心3 min， 弃上清，用100L生理盐水将沉淀悬浮，取25L菌体悬 浮液分别和等体积的25L生理盐水、猪链球菌2型阳性血 清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察 待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理 盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现 凝集为阳性反应。 4PCR基因鉴定 挑取分离纯化的菌落或选择平板上湿润的可疑菌落，利用 特异引物进行PCR扩增。进行链球菌属特异性引物（tuf） 、猪链球菌种特异性、猪链球菌2型荚膜多糖基因（cps2j ）、猪链球菌溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp） 及猪链球菌溶血素基因（sly）检测。对已经大量使用抗 菌药物治疗的患者，可将采集标本直接进行PCR法检测， 确认猪链球菌种特异性基因（16SrRNA），以及特有的毒 力基因，若为阳性者则作为确诊病例。 基因鉴定，使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析检测猪 链球菌种特异性16S rRNA。 上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa 检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2j） 上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc 检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp） 上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc 下游引物：agtctctaca gctgtagctg g PCR反应的条件： 94预变性5分钟;94、30秒，60、30秒，72、30 秒，25个循环，最后延伸72、5分钟。取5微升扩增产物 在1.2的琼脂糖凝胶中进行电泳。 5、检测过程中防止交叉污染的措施 1）抽样和制样过程 抽样和制样工具，应清洗干净，121、15 min-20 min 灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用。存放样品的容器 应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。 2)检测过程 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR 区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产 物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净 区”到“脏区”单方向进行。 实验过程中，应穿实验服和戴手套，手套要经常更换。 各区要有专用实验服，经常清洗。 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专 用，不得带出该区。 所有溶液、水、耗材和器具要121、15 min- 20 min 灭菌，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高 质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在20-25贮存的试剂 中，可加0.025%的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制， 然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。 装有DNA模板或引物的离心管打开之前，要简短离心， 离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。 茼PCR区中，最好能在PCR操作箱中加入PCR反应各组分 。 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA。 可使用UDG和dUTP系统控制污染。 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 6、符合以下特性者应判为猪链球菌2型； 猪链球菌2型在36培养24 h后，在普通琼脂绵羊 血平板和选择性普通琼脂绵羊血平板上形成圆形、微凸、 表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3 mm-lmm，大多数菌株 呈a溶血，部分菌株产生p溶血； 革兰氏阳性球菌，单个、成对或成链存在； 过氧化氢酶试验阴性； 发酵5%乳糖和海藻糖产酸，发酵七叶苷，不发酵甘露 醇和山梨醇，不水解马尿酸钠（