免疫学技术第九讲ppt课件

免 疫 学 技 术 主 讲：李 影 动物科学技术学院 预防兽医学教研室 免疫学技术：利用抗原、抗体特异 性反应的原理建立的各种检测与分 析技术，以及建立在这些技术之上 的各种制备方法。一般将涉及到抗 原、抗体、免疫细胞、细胞因子等 相关技术都称为免疫技术。 分类 1、免疫血清学技术 2、细胞免疫技术 3、免疫制备技术 4、分子免疫学技术 免疫学技术的应用 1、疾病诊断。 2、生物活性物质的超微定量。 3、物种鉴定（血清型、亚型分析等）。 4、微生物检测。 5、开发研制免疫增强药物、饲料添加剂 、 疫苗等。 6、分子生物学领域。 主要内容 一 免疫血清学技术 二 主要血清学技术 三 细胞免疫技术 四 主要细胞免疫技术 专题一：免疫血清学技术 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 1 1、血清学技术：简单地说指体外的抗原与抗体反应，、血清学技术：简单地说指体外的抗原与抗体反应， 由于抗体多来自于血清故称血清学。由于抗体多来自于血清故称血清学。 2、分类： （1）凝聚性反应：凝集反应；沉淀反应 （2）标记抗体技术：荧光抗体，本酶标抗体， 放射性标记抗体 （3）补体参与的反应：补体结合反应； （4）中和反应：病毒中和试验 （5）免疫转印：Westen Blotting 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 3 3、特点：、特点： （1）特异性和交叉性 如猪瘟病毒抗体只能与猪瘟病 毒结合，说明具有特异性；牛痘病 毒来预防人的天花和猪瘟疫苗预防 牛的病毒性腹泻病的例子说明具有 交叉性。 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 3 3、特点：、特点： （2）最适比和带现象 带现象指因抗原或抗体过多 而出现的抑制可见反应的现象， 抗体过多易出现前带反应；抗原 过多易出现后带现象。 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 3 3、特点：、特点： （3）反应的两阶段性 第一阶段为抗原与抗体的特 异性结合，反应快，几秒钟至几 分钟；第二阶段为抗原与抗体的 可见现象阶段。 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 3 3、特点：、特点： （4）反应的可逆性 抗原与抗以弱的非共价键结合 ，受物理化学热力学法则制约。 在0-40度内，PH4-9范围易结合 ；如果温度超过60度或PH降至3 度以下，抗原抗体复合物又可重 新解离。 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 3 3、特点：、特点： （5）反应的敏感性 可用于定性，还可以检测 极微量的抗原或抗体，其灵敏 度大超过了常规的化学方法。 一、免疫血清学技术一、免疫血清学技术 4 4、影响血清学反应的因素、影响血清学反应的因素 电解质：一般用NaCl作稀释液；标 记抗体常用PBS磷酸盐缓冲溶液。 温度：一般较高温度可增加抗原与 抗接触的机会，超过60度易解离。 酸碱度：PH6-8较合适。 二、主要血清学技术二、主要血清学技术 （一）凝集反应（一）凝集反应 1 1、概念：颗粒性抗原（如细菌、红细胞）与相应、概念：颗粒性抗原（如细菌、红细胞）与相应 抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。 2、分类：直接凝集反应、间接凝集反应、反 向间接凝集反应、协同凝集反应等。 3、用途：如血型鉴定、牛布病检测、鸡白痢 诊断等。 二、主要血清学技术二、主要血清学技术 （二）沉淀反应（二）沉淀反应 1 1、概念：可溶性抗原、概念：可溶性抗原（细菌外毒素、内毒素，（细菌外毒素、内毒素， 菌体、裂解液、血清、组织浸出液）菌体、裂解液、血清、组织浸出液）与相应与相应 抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。抗体，在电解质存在下，发生凝集的反应。 2、分类：单向琼脂扩散、双向琼脂扩散、对 流免疫电泳、火箭电泳等。 3、用途：如炭疽、小鹅瘟诊断等。 Ascoli AgAb 对流免疫电泳 二、主要血清学技术二、主要血清学技术 （三）免疫标记技术（三）免疫标记技术 1 1、概述：抗原与抗体能特异性结合，但抗体抗原、概述：抗原与抗体能特异性结合，但抗体抗原 分子小，含量低时，形成的复合物是不可见的分子小，含量低时，形成的复合物是不可见的 。如果将超微量的物质标记（荧光素、酶、放。如果将超微量的物质标记（荧光素、酶、放 射性同位素）就可检测出微量的抗原与抗体复射性同位素）就可检测出微量的抗原与抗体复 合物，其特异性与敏感性远远超过常规血清学合物，其特异性与敏感性远远超过常规血清学 方法，被广泛用于病原微生物鉴定，传染病诊方法，被广泛用于病原微生物鉴定，传染病诊 断及基因表达产物分析等。断及基因表达产物分析等。 二、主要血清学技术二、主要血清学技术 （三）免疫标记技术（三）免疫标记技术 2、分类： （1）免疫荧光技术 （2）免疫酶技术 （3）放射免疫测定法 （4）免疫印迹法 （5） 免疫金标技术 （6） 免疫PCR 小鼠脾脏免疫荧光图像 免疫酶技术 3 3、免疫酶技术、免疫酶技术 （1）原理：通过化学方法将酶与抗体或抗抗 体结合，形成酶标记物，这些酶标记物仍 保持免疫学活性和酶的活性，然后将它与 相应的抗体或抗原起反应，形成酶标记的 抗原-抗体复合物，结合在免疫复合物上的 酶在遇到相应的底物时，而显色。 3 3、免疫酶技术、免疫酶技术 （2）分类： 免疫酶组化 法 免疫酶测定 法 酶标记抗体法 抗酶抗体法 液相测定法 固相测定法 间接法 双抗体夹心法 竞争法 免疫酶技术 3 3、免疫酶技术、免疫酶技术 （3）特点： 灵敏度高，检测能力可达毫微克水平。 应用范围广，既能测抗体又能检测抗原， 既能定性又能定量、定位及抗原分析。 标本可长期保存。 酶标记物有效时间较长，一般低温保存可 达一年以上。 不需要特殊设备。 （4）操作过程： 二、主要血清学技术二、主要血清学技术 （四）补体结合技术（四）补体结合技术 专题二：细胞免疫技术 1、概述：细胞免疫检测主要包括T细胞及 亚群的计数、T细胞活性测定、各种淋巴 因子的检测、K细胞、NK细胞活性试验， 以及皮肤过敏试验等。 2、用途： （1）测定疾病个体的细胞免疫状态及水平； （2）筛选免疫增强剂或免疫抑制药物； （3）测定淋巴因子活性等 细胞免疫技术 3、分类： E花环试验 淋巴细胞转化试验 白细胞移动抑制试验 白细胞介素测定 酸性醋酸萘酯酶测定 主要细胞免疫技术 （一）E玫瑰花环试验 1、原理：人、猪、牛、羊 等的T细胞膜上的CD2是绵羊 红细胞受体，马、猪的T细 胞膜上的CD2是豚鼠红细胞 的受体。 2、用途：区分T淋巴细胞 主要细胞免疫技术 （二）淋巴细胞转化试验 1、原理： PHA+T细胞（有PHA受体） 转化 大的淋巴母细胞 显微镜观察计算转化率 转化率=(过渡型细胞+母细胞)/200个淋巴细胞100% 2、用途：淋巴细胞计数，监测免疫机能 3、特点：简便、准确性差 形态学法 3H胸腺嘧啶核苷（3H-T）掺入法 原理： 试验管 对照管 PHA+T细胞+3H-TdR PHA+T细胞 转化 转化 淋巴母细胞 淋巴母细胞 （掺入3H-TdR） （无3H-TdR掺入） 液体闪烁仪测掺入 测CPM 3H-T的脉冲数CPM 计算转化刺激指数SI=试验管CPM/对照管CPM 特点：准确，需昂贵的闪烁仪 原理：PHA、ConA+T细胞（受体） 转化 分裂、增殖 脱氢酶 甲氮唑盐（MTT） 甲簪（formazan） 酶标仪（595nm）测OD值 特点：敏感、准确 MTT比色法 主要细胞免疫技术 （三）酸性醋酸萘酯酶测定 1、原理：T淋巴细胞浆内含有的酸性醋酸萘 酯酶，在弱酸性条件下，能使底物酸性醋酸 萘酯水解成醋