《临床免疫学》本科课件22免疫学检测技术

特异性 比例性 可逆性 阶段性 电解质 生理盐水或缓冲液，Ca2+，Mg2+ 酸碱度 pH68，补体pH7.37.4 温度 1540，37最适 冷凝集素4最适 颗粒性抗原或吸附于载体颗粒上的可溶 性抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原） 结合，在电解质参与下，出现肉眼可见的 凝集现象。 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的 参与下，出现肉眼可见的凝集现象。 常用颗粒性抗原：红细胞、细菌等 玻片法和试管法 玻片凝集试验玻片凝集试验 阳性阴性 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体 表面，与相应的抗体或抗原结合，在电解 质的参与下，出现肉眼可见的凝集现象。 用已知抗原致敏载体 - 检测未知抗体 用已知抗体致敏载体 - 检测未知抗原 沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结 合，在一定条件下出现肉眼可见的沉 淀现象。 液相内沉淀反应 环状沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀反应 单向扩散试验 双向扩散试验 免疫电泳技术 可溶性抗原与相应抗体在特殊缓冲液中能 快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使 反应液体变浑浊，呈现一定的浊度。 当抗体量恒定且过量时，浊度与抗原的量 成正比。 利用光学测量仪器对浊度进行测定，从标 准曲线查出抗原含量。 检测器A 检测器B IC I0 I I 透射比浊法 散射比浊法 可溶性抗原与相应抗体在含有电解 质的凝胶中向四周扩散，形成浓度梯 度，两者相遇并在比例合适处形成肉 眼可见的白色沉淀物。 原理： 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测 抗原在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成 沉淀环，沉淀环大小与抗原浓度呈正相关 。 （沉淀环直径)2 抗原浓度 1.抗体混于凝胶中 2.抗原加入孔内 3.抗原自由扩散 标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找 相应抗原浓度 原理： 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板 的对应孔中，两者各自在凝胶中向四 周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在 比例合适时形成沉淀线。 AbAg 模拟图 染色标本图 1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧 1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。 “1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。 n n 免疫技术免疫技术 n n 以以抗原抗原- -抗体反应抗体反应原理为基础，对样品中相应原理为基础，对样品中相应 抗原或抗体进行检测。抗原或抗体进行检测。高特异性高特异性 n n 标记技术标记技术 n n 将可被探测的将可被探测的示踪物质（酶、荧光素、放射性示踪物质（酶、荧光素、放射性 核素、胶体金、化学发光物质等）核素、胶体金、化学发光物质等）用化学方法用化学方法 与化合物连接。与化合物连接。高敏感性高敏感性 常用免疫标记技术 n n 放射免疫技术放射免疫技术 n n 荧光免疫技术荧光免疫技术 n n 酶免疫技术酶免疫技术 n n 胶体金免疫技术胶体金免疫技术 n n 化学发光免疫技术化学发光免疫技术 n n 生物素生物素- -亲和素免疫技术亲和素免疫技术 基本原理： 酶免疫技术是利用酶标记抗体(抗原) 与相 应抗原(抗体)反应形成抗原-抗体-酶复合物 ，酶催化相应的底物显色，根据颜色变化 和显色深浅进行定性和定量。 辣根过氧化物酶（HRP） n ELISA中应用最为广泛的标记酶 nHRP常用底物 n四甲基联苯胺 TMB n无色蓝色黄色 微量反应板 E 固相抗体 标本（含抗原） 酶标抗体EE 底物 双抗体夹心法检测抗原 固相抗 原 标本（含 抗体） 酶标二 抗 底 物 E EE 间接法检测抗体 （二）荧光免疫技术 荧光物质： 荧光物质是一类经激发能发射荧光的 物质。 荧光色素： 能产生明显荧光并可用作 染料的有机化合物 常用荧光色素 1. 荧光色素：FITC、RB200、PE等 FITCRB200 1、直接法 荧光素标记抗体 F 抗原 荧光抗体技术类型 2、间接法 F 荧光素标 记抗体 抗原 抗体 阳性细胞显色有胞质型、胞核型、膜表面型， 显色深浅可作为抗原定性、定位和定量依据。 “-”为无或仅见极微弱荧光； “+”为荧光较弱但清楚可见； “2+”为荧光明亮； “3+”为耀眼的强荧光。 “2+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“”。 结果判定 自身抗体检测 抗核抗体(均质 型) 抗核抗体(核膜 型) 抗核抗体(斑点 型) 荧光抗体技术的应用 （三）放射免疫技术 电化学发光免疫分析（ECLIA）是 以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体 (抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体 ，在电场中因电子转移而发生特异性 化学发光反应。 （四）电化学发光免疫（四）电化学发光免疫技术技术 电化学发光免疫测定示意图电化学发光免疫测定示意图 46 （五）胶体金免疫技术（五）胶体金免疫技术 金免疫技术（免疫金标记技术、免疫胶体金 技术）是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗 体检测的一种新型的免疫标记技术。 胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白 磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合 成为特定大小的金原子颗粒，并由于静电作用成 为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。 样 品 垫 结 合 物 垫 NC 膜 吸 水 垫 样 品 垫 结 合 物 垫 NC 膜 吸 水 垫 试验试验方法方法 免疫层析试验以双抗体夹心法为例。 免疫印迹试验 （六）免疫印迹（六）免疫印迹技术技术WesternblotWesternblot PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：ficollhypaque，percoll 一、免疫细胞的分离和纯化一、免疫细胞的分离和纯化 聚蔗糖-泛影葡胺分层液(ficoll)法是一种单次 密度梯度离心分离法，主要用于分离外周血中的 单个核细胞。 原理： Ficoll分层液：密度1.0770.001 将肝素抗凝全血加在分层液上，水平离心 聚蔗糖聚蔗糖- -泛影葡胺分离法泛影葡胺分离法 FicollFicoll分层液分离单个核细胞示意分层液分离单个核细胞示意 图图 方法类型： 1.E花环沉降法T细胞-绵羊红细 胞受体(CD2) E花环沉降法 2.2.荧光荧光激活细胞分选仪分离法激活细胞分选仪分离法 喷嘴 Fluorescence signals Focused laser beam 鞘液 液流系统示意图液流系统示意图 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detector 光学系统示意图光学系统示意图 光学系统光学系统 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴含细胞的液滴 弃去 偏转落入收