犬小孢子菌课件

犬小孢子菌犬小孢子菌SSHSSH 文库中差异基因文库中差异基因 的研究的研究 硕士研究生：张渊 指 导 教 师：杨国玲 教授 专 业 名 称：皮肤病与性病 前 言 |犬小孢子菌主要侵犯儿童 |引起白癣、脓癣和体癣 |儿童头癣48% 儿童体癣36% 成人头体癣16% 研究背景 1.儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用 犬小孢子 菌儿童头癣 发病机制 推测儿童头皮是否诱导 犬小孢子菌毒力因子 ？ ？ 材 料 |前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆 |主要试剂： 1. DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2. 杂交膜 3. Real time PCR Kit |主要仪器： 1. CL1000紫外交联仪（UVP） 2. Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System 儿童头皮 培养菌株 (tester) 儿童光滑皮肤 培养菌株 (driver1) 成人头皮组织 培养菌株 (driver2) 斑点杂交 实时PCR 技术路线 获得差 异基因 前期完 成试验 消 减 文 库 SSH 方法-斑点杂交 正反向 消减文库 PCR扩增 制备探针 酶切回收 杂交膜 DIG-High Primer 探针 菌液PCR产物 阳性克隆测序 n阳性克隆菌液送大连 宝生物测序：菌种为 DH10B，载体为PMD- T18 n测序使用引物为：F Primer（M13-47）； R Primer（RV-M） 测序分析 序列预处理 去除混杂基因 同源性比对 功能分类 实时PCR Tester mRNA Driver1 mRNA Driver2 mRNA 2个 基因 2个 基因 18S rRNA 3个RNA池均为构建消减文库时保 存的总RNA 探针引物序列 结 果消减文库酶切前 后结果 结 果-斑点 杂交 消减文库1斑点杂交部分结果 正向 反向 正向 反向 消减文库2斑点杂交部分结果 结 果-斑点杂交 阳性克隆测序及分析 共得到106个有效序列 共得到13个ESTs 8个ESTs找到了同源基因 6个同源基因具有功能分类 消减文库1差异基因比对结果 消减文库2差异基因比对结果 蛋白功能分类 实时PCR-18s rRNA 18s rRNA基因在3个RNA池 中的实时PCR表达情况 FSH1基因在tester RNA池和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR- FSH1 PQ-LRP基因在tester RNA和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR- PQ-LRP P-GAL4基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR- P-GAL4 NADH1基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR- NADH1 4个ESTs表达的相对表达倍数关 系 讨 论 犬小孢子菌 致病因子表达 犬小孢子菌 主要致儿童头癣 儿童头皮组织 结构蛋白差异 利用SSH 可能影响 讨 论 Tester和driver作为探针低丰度基因的丢失 正反向消减DNA作为探针避免低丰度基因的丢失 高背景，阳性率降低 去掉接头降低背景，筛选差异基因 实时PCR 实时监测 高特异性 高灵敏性 讨 论 儿童头皮培养菌株 儿童光滑皮肤培养菌株 构建文库 富集差异基因 成人头皮培养菌株 讨 论 讨 论-FSH1 n目前对FSH1的研究主要 是对其结构的分析 nFSH1是酯酶，水解疏水 磷酸酯、油酯化合物 nFSH家族功能较多：蛋白 酶作用 、调控因子作用 等 nFSH1在此发挥蛋白酶作 用还是调控因子作用还 不清楚 Sophie Quevillpn-cheruel 讨 论-PQ-LRP nPQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重复的环结构 （ 环1和环2） n环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要 n半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢 nPQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强 有关 nPQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子 讨 论-NADH1 nNADH1是呼吸链的组 成部分，参与ATP的 生成 n犬小孢子菌ATP利用 率的增加，可能与其 在儿童头皮组织中生 长更活跃有关 讨 论-P-GAL4 nP-GAL4基因属于GAL4家 族，含有一个真菌中独有 的GAL4域 nGAL4家族普遍的功能是转 录调节，主要调控氮源代 谢、生殖繁殖等 n在本研究中，P-GAL4基因 在此可能是调控真菌的生 殖，导致犬小孢子菌在儿 童的头皮组织中大量繁殖 ，导致头癣的发生 结 论 nSSH1文库得到5个差异基因： 1. FSH1 2. PQ-LRP 3. multidrug resistance protein MDR 4. RING zinc finger protein 5. RING zinc finger protein, putative 结 论 nSSH2文库3个差异基因： 1. P-GAL4 2. NADH1 3. DNA-directed RNA polymerase I subunit 结 论 nFSH1和PQ