医学综述论文：雌激素对去卵巢大鼠骨丢失的骨形态计量学及组织学的影响

1 / 13 医学综述论文：雌激素对去卵巢大鼠骨丢失的骨形态计量学及组织学的影响 【摘要】 目的 了解大鼠卵巢性激素缺乏致骨丢失的组织学改变以及四种不同雌激素制剂对其的影响。方法 将50 只 SD 大鼠随机分为 6 组，去势组 (9 只 )在去势手术后 3周处死大鼠；对照组 (9只 )开腹后关腹；去势 +利维爱组、去势 +盖福润组、去势 +倍美力组、去势 +维尼安组 (各 8 只 )在去势手术后 3周予相应的药物治疗，术后 6周 (药物治疗后 3周 )处死各组大鼠，进行骨形态计量学、骨密度 (BMD)测定，并行病理及电镜下观察。结果 (1)去势后 3 周大鼠骨量参数 较对照组显著减少 (P0.05)。去势 +倍美力组和去势 +维尼安组骨小梁的体积与去势组相似。 BMD在各治疗组均有增加，以去势 +利维爱和去势 +盖福润组增加较多 (PThe Impacts of Sex Hormones on Histomorphometric and Histological Appearances of Bone in Ovariectomized Rats YONG Hongyan*, CHENG Yunying.* Nanjing Medical University No1 Affiliated Hospital, Nanjing 210006 【 Abstract】 Objectives To demonstrate the histomorphometric and histological changes of bone 3 weeks after bilateral ovariectomy in rats and to investigate the impacts of 4 different hormone 2 / 13 replacement therapies on the bone histomorphometric, hostological appearances. Methods Bilateral ovariectomies were done on 41 female rats and sham operations on other 9 (sham group ) respectively . After 3 weeks , 4 different treatments : ie Livial , Gevrine , Premarin , Weinian were initiated separately on each 8 ovariectomized rats for another 3 weeks . The remaining 9 were served as controls (OVX group ) . All rats were sacrified either 3 weeks after ovariectomy / sham operation or at the end of hormone therapies . Their femoral bone mineral density (BMD) were measured by dual energy X-ray absorptiometry ( DEXA ) . Specimens of proximal femur were embedded undecacifide for histomorphometric analysis and of distal femoral metaphysics were procured for scanning electron miroscope (SEM) and pathologic examinations. Results (1) Three weeks after OVX , the femoral BMD, mean cortical thickness decreased significantly while the number of osteoclast increased significantly as compared with sham group. The trabecular became thinner and irregular which changed the bone microstructure in three dimension. (2) After treatment of 4 different 3 / 13 preparations, the above parameters restored to various extents to the sham operation levels. Among them, there was greater increase of femoral BMD on the Livial and Gevrine group as compared with Premarin and Weinian group (P 近年来的研究表明，卵巢性激素缺乏引起的骨丢失与成骨细胞、破骨细胞及骨小梁的显微结构有关。激素替代治疗 (HRT)是防治绝经后骨质疏松症的关键措施。目前临床常用的雌激素制剂有利维爱 (Livial)、盖福润(Gevrine)、倍美力 (Premarin)和维尼安 (Weinian)。 本研究通过对去势后大鼠骨密度 (BMD)的测定、骨吸收及骨转换参数的定量分析，骨小梁的结构观察，探讨卵巢性激素缺乏导致骨丢失的组织学改变，综合评估上述 4种雌激素制剂的疗效。 材料和方法 一、动物分组及模型制备 选取 3 月龄未经产雌性 SD 大鼠 50 只平均体重(20010) g ，随机分为 6组，去势组 9 只，对照组 9只，去势 +利维爱组、去势 +盖福润组、去势 +倍美力组与去势 +维尼安组各 8只，组间大鼠体重无统计学差异。所有大鼠均以3%的戊巴比妥钠 (40 mg/kg)腹腔内注射麻醉，除对照组行单纯开腹之外，其余 5 组均行双侧卵巢切除术，术后置大鼠于室温下分笼饲养，自由摄水，每天每只予标准饲料 18 g 1。 4 / 13 二、方法 (一 )药物治疗 术后 3周开始给各治疗组大鼠用药，所有药物均以无菌生理盐水配成混悬液，以 灌胃法每天每只 2 ml 给药。动物用量剂量 (mg/kg)=6.25 人的剂量 (mg/kg) 2，即给药剂量：去势 +利维爱组每天利维爱 0.033 mg/kg；去势 +盖福润组每天盖福润 0.8 mg/kg；去势 +倍美力组每天倍美力0.003 mg/kg；去势 +维尼安组每周维尼安 0.003 mg/kg。连续给药 3 周，在处死前第 10和第 3 天，每日以 20 mg/kg四环素 (上海华美公司 )腹腔内注射。术后 3周处死去势组，术后 6 周 (给药 3周后 )处死其他各组。 (二 )骨组织形态计量学分析 1.不脱钙切片取材及 制作：截取双侧股骨远端 1/3 处骨，丙酮脱水、脱脂， 24小时内每隔 6小时换液 1 次。低温塑料 (甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸羟乙酯，丙烯酸羟乙酯 )包埋， 4 冰箱聚合。包埋标本用德国 JUNG型硬切骨机沿股骨矢状面切片，每只鼠切片 4 张，切片厚度为 5 m ，其中2 张切片采用 1%的甲苯胺蓝染色，另外 2张切片不染色作为荧光观察用。 2.参数测量：采用德国 ZEISS 公司 VIDAS型计算机全自动图像分析系统，每只鼠观察荧光染色切片各 2 张，观察甲苯胺蓝染色切片各 2张，每个参数测量取高倍视野，测定5 / 13 区域限定在距骺板下 1 cm 外 的干骺端，每个标本测定面积为 16 mm2，所有参数均参照 Wronski 等 3和 Malluche 等 4的标准，骨量参数： (1)骨小梁体积 (%)： (骨小梁面积/髓腔及骨小梁面积 )100% ； (2)骨小梁平均厚度 (m) ； (3)皮质骨平均厚度 (m) ；骨吸收参数：骨小梁表面破骨细胞数 (103/m); 骨转化及骨形成参数： (1)骨小梁骨矿化率(m/d) ：两条荧光标记线间距 /两次注射四环素间隔天数(图 1)； (2)骨小梁矿化缘长度 (%)：四环素标记线长度 /骨小梁边缘长度。 图 1 四环素荧光双标线。荧光双标 100 (三 )扫描电镜观察 取股骨干骺端，沿矢状面剖开，以浓度为 4%的戊二醛固定，磷酸缓冲液清洗 3 次；以浓度为 10%的次氯酸钠浸泡6 小时，超声清洗 15分钟，乙醇逐级脱水，乙醚浸泡。室温下空气干燥；真空喷金。在日本产明石 SX-40型电镜下观察(放大倍数 700倍 )。 (四 )组织形态学观察 取大鼠股骨干骺端，以浓度为 10%的甲醛液常规固定，脱钙处理后石蜡制片。 HE染色，光镜下观察。 (五 )BMD测量 将大鼠经乙醚麻醉后称重，四肢展开平置于美国6 / 13 Lunar 公司生产的双 能 X 线吸收测量仪平台上，通过计算机系统中小动物软件测股骨 BMD，精确度 1.2%，准确度 90%。 三、统计学方法 采用本校统计中心 CCSTAT 软件包进行统计运算，所有参数均以 s 表示，组间差异采用方差分析、显著性 t 检验。 结 果 一、实验后大鼠体重变化 术后 3周，各组大鼠体重均有所增加。实验结束时除去势组与去势 +利维爱组体重增加较明显外，其余各组大鼠体重均维持在给药前水平。见表 1。 表 1 各组大鼠实验前后体重比较 (g,s) 组别 只数 实验前体重 实验后体重 去势组 9 210.37.0 242.09.5* 对照组 9 207.26.9 228.04.1 去势 +利维爱组 8 204.57.1 238.05.5* 去势 +盖福润组 8 207.39.5 226.05.3 去势 +倍美力组 8 209.83.0 221.07.0 去势 +维尼安组 8 209.37.0 226.08.7 * 与对照组相比， P 二、 BMD的变化 7 / 13 术后 3 周，去势组与对照组相比， BMD 明显降低 (P 表 2 各组大鼠术后 BMD 的 变化 (g/cm2,s) 组别 只数 术后 3 周 术后 6周 去势组 9 0.1990.02 0.1890.02* 对照组 9 0.2400.03 0.2370.03 去势 +利维爱组 8 0.1960.02 0.2230.03 去势 +盖福润组 8 0.2010.03 0.2280.04 去势 +倍美力组 8 0.1930.02 0.2110.03* 去势 +维尼安组 8 0.1980.03 0.2080.02* * 与对照组相比， P 三、骨形态计量学参数变化 与对照组相比，去势组骨小梁体积减少 24.1%(P 表 3 各组大鼠骨组织形态计量学参数比较 组别 只 数 骨小梁 体积 (%) 骨小梁平均 厚度 (m) 皮质骨平均 厚度 (m) 骨小梁表面破骨 8 / 13 细胞数 (103/m) 骨小梁骨 矿化率 (m/d) 骨小梁矿化缘 长度 (%) 去势组 9 27.44.2* 40.78.9* 18525* 1.50.5* 1.650.40* 54.012.6* 对照组 9 36.13.7 50.97.3 35471 0.60.3 1.180.30 42.74.4 去势 +利 维爱组 8 35.34.2* 47.95.1* 34958* 0.60.1 0.880.33 40.13.7 去势 +盖 福润组 8 34.04.1* 48.48.5* 354 6* 0.80.3 0.860.23 38.84.2 去势 +倍 美力组 8 28.63.1 44.03.9 32147* 0 .90.4* 1.160.41* 42.03.5* 去势 +维 尼安组 8 27.73.3 42.36.4 28027* 1.00.3* 9 / 13 1.210.21* 43.44.6* * 与对照组相比， P0.05)。 四、骨组织的形态学观察 1.HE 染色切片： (1)去势组股骨干骺端骨小梁明显变稀疏，皮质骨变薄，骨髓腔相对扩大 ，部分区域骨小梁消失，沿 “S” 形的骨小梁边缘有众多深浅不一的吸收陷窝，有些部分由于破骨细胞的溶骨作用，小梁出现中断 (图 2)。(2)对照组及治疗组股骨干骺端骨小梁丰富，皮质骨致密，小梁排列以纵向为主。在皮质骨形成表面 4个治疗组均可见成队状排列似上皮细胞样覆盖于新生骨表面的成骨细胞，呈立方型、柱状和豆点状，有些细胞间有裂隙相连 (图 3)。 2.甲苯胺蓝染色切片： (1)去势组可见小梁表面矿物质沉积较少，类骨质生成较多，皮质骨亦变薄，小梁表面骨吸收陷窝中有外形较大、淡染、胞浆分布均匀、内有多个细胞核的破骨细胞充填 (图 4)。 (2)对照组甲苯胺蓝染色的切片中，骨小梁呈纵向排列，纵向小梁间由横向小梁相连，小梁中央有大量紫蓝色的矿 物质沉积，其上有较多的骨细胞嵌于其中，矿化骨的两侧为浅染的类骨质 (图 5)，去势 +利维爱和去势 +盖福润两组骨小梁的表面有大量的成骨细胞，局部骨小梁形成表面活跃，髓腔内偶见有破骨细胞及类似破骨细胞的巨噬细胞 (图 6)。 10 / 13 图 3 皮质骨致密，表面豆点状、柱状成骨细胞 () 。 HE染色 100 图 4 骨小梁稀疏，表面骨吸收陷窝增多 () 。甲苯胺蓝染色 100 图 5 骨小梁排列以纵向为主。甲苯胺蓝染色 100 图 6 骨小梁表面矿物质沉积及大量成骨细胞 () 。甲苯胺蓝染色 200 3.扫描电镜： (1)去势组小梁变细、中断，残端游离，小梁数量减少，小梁间距增宽，表面较多的骨吸收陷窝，局部骨小梁变细，有裂隙 (图 7)。 (2)对照组及治疗组骨小梁相互连接成立体网状，小梁表面光滑，小梁间距小 (图 8)。 图 7 骨小梁变细，残端游离 () 。扫描电镜 700 图 8 骨小梁排列整齐，表面光滑。扫描电镜 700 讨 论 一、实验前后大鼠体重的变化及实验时间的选择 本研究结果表明，雌激素具有维持体重的作用。利维爱对体重增加更明显，可能与其雄激素样作用有关。盖福润对体重增加不明显可能与甲基睾丸素口服 后活性降低 50%以上有关。卵巢切除后引起骨丢失的时间长短不一。 Kimble等 1认为，卵巢切除后 2 周的大鼠，骨小梁和皮质骨与对照组相比较变化不明显，而 4 周后骨丢失则明显增加， 2 周的替代治疗可以抑制骨吸收。本研究结果表明，去势后 3 周11 / 13 的大鼠骨转换即加快，骨吸收明显增加。 二、卵巢切除后大鼠 BMD、骨形态计量学及组织学的改变 BMD 是骨矿代谢中量化骨量的重要指标。本研究结果表明，去势后 3周的大鼠 BMD明显下降，提示大鼠卵巢切除后早期处于快速骨丢失阶段。 骨矿化率和矿化缘的长度，反映了成骨 细胞生成类骨质速度的快慢。卵巢切除后两者均增加，说明成骨细胞活性增强，骨重建活跃。而 3 个骨量参数均降低及破骨细胞数增多，说明骨量明显丢失。推知，在去势后早期快速骨丢失阶段，骨吸收及骨形成是同时存在的。破骨细胞活性增强和高转换应是早期快速骨丢失的机理之一。本研究结果与文献报道相符合 5。同时本研究结果提示，卵巢切除后的骨吸收主要以破骨细胞性骨吸收为主，即破骨细胞将骨组织、胶原及矿化骨不断从骨小梁表面降解、吸收，使骨小梁间隙增宽、中断。 显微骨折的修复作用降低，是骨折发生的病理学基础 6。本研究结果 提示，松质骨的力学强度下降，是造成骨显微骨折的主要原因。松质骨和密质骨的变化在卵巢切除早期是相同的。 三、各种雌激素制剂对去势大鼠 BMD、骨形态计量学12 / 13 及组织学的改变 各给药组与去势组相比， BMD 均有所增加，以去势 +利维爱、去势 +盖福润组增加较多 (P 本研究受江苏省科委社会发展基金资助 作者单位： 210006 南京医科大学附属南京第一医院妇产科 ( 红岩 )；南京铁道医学院附属医院妇产科 (程云英 ) 参考文献 1 Kimble RB, Matayoshi AB, Vannice JL, et al. Stimulaneous block of interluekin-1 and tumer necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endo crinology, 1995, 136:3054-3061. 2 施新猷 .医学动物实验学 .西安：陕西科学技术出版社， 1989.418-420. 3 Wronski TJ, Walsh CC, Ignaszewski LA, et al. Histologic eidence for osteopen