（植物学专业论文）一个拟南芥叶卷曲突变体的性状遗传分析及基因定位.pdf

摘要 叶是植物体的基本营养器官。叶的发育受基因和环境因素共同调 节。叶的极性建立直接决定了叶的平展性发育，极性改变会破坏大多 数植物叶的平展性，影响植物体的光合作用、蒸腾作用和抗逆性等生 理功能。了解叶极性或叶卷曲发生的遗传规律，对于研究叶发育的调 控机理具有非常重要的理论意义。 本论文以正向遗传学的方法研究一个引起叶发育异常的突变基 因功能，利用图位克隆的方法从拟南芥- c j 突变体中克隆相应的基 因。主要的结果和结论如下： 1 ) 突变体形态学观察：- c j 突变体的莲座叶在横向和纵向都出 现不同程度的卷曲，而且是越在早期卷曲程度越大，到了叶发育的后 期卷曲程度明显变小了。同时，叶张角变大。到花发育时期有茎节出 现，并弯曲，果荚着生的角度也发生变化。 2 ) 研究了该突变体对激素的反应，分别将突变体和野生型在不 同浓度激素的作用下生长，发现突变体在高浓度i a a 处理下对i 从的 抑制作用比野生型敏感。 3 ) 对突变体进行遗传分析，将突变体与野生型进行杂交，自交。 f 1 表现为野生型性状，f 2 出现性状分离，f 2 群体中野生型性状和突 变体性状的植株分离比例为3 ：1 ，说明该突变为隐性单基因突变。 4 ) 利用图位克隆技术，已将突变基因初步定位于拟南芥的第三 条染色体上，与分子标记g a p a b 紧密连锁。 关键词拟南芥c 口，突变体叶卷曲 i 从图位克隆s s l p a b s t r a c t l e a fi st h eb a s i cn u t r i t i o n a lo r g a n so fh i g h e rp l a n t s r e g u l a t o r ym e c h a n i s mo f1 e a fd e v e l o p m e n ti sv e r yc o m p li c a t e d t h e d e v e l o p m e n t o f 1 e a fi su n d e rt h ec o n t r 0 1o fb o t h e n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa n di n t e r n a lg e n e ti cf a c t o r s t h e i d e n t i t yo f1 e a fp o l a r i t yd e t e r m i n e sl e a ff l a t n e s sd e v e l o p m e n t d i r e c t l y ，a n da b n o r m a lp 0 1 a r i t yu s u a l l yr e s u l t si nt h ea b n o r m a l l e a ff l a t n e s s ， s u b s e q u e n t l y a f f e c to n m a n yp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s ， s u c ha s p h o t o s y n t h e s i s ，t r a n s p i r a t i o na n d a n t i s t r e s s h e n c e ， u n d e r s t a n d i n gt h eg e n e t i cm e c h a n i s mo f 1 e a fp o l a r i t yo r1 e a fc u r v a t u r eh a st h et h e o r e t i cs i g n i f i c a n c e f o rc o n t r 0 11i n gl e a ff o r ma n ds h a p e ， a n df o rt h e1 e a f d e v e l o p m e n tt h e o r y i nt h i sp a p e r ，w es t u d i e da b n o r m a ll e a fd e v e l o p m e n tm u t a n t g e n ef u n c t i o nb yam e t h o do fb e i n gag e n e t i c t h em u t a n tg e n e w a sc l o n e db yu s eo fm a p b a s e dc l o n i n gm e t h o df r o m 舭6 j ( 7 匆p s j t h em a i nf i n d i n g sa n dc o n c l u s i o n sa r ea sf 0 1 l o w s 1 ) m o r p h 0 1 0 9 i c a lo b s e r v a t i o no fm u t a n t ： 1 e a fo fm u t a n t i nb o t hh o r i z o n t a la n dv e r t i c a lc o il st ov a r y i n gd e g r e e s ，i t w a sm o r eg r e a td e g r e eo fc u r li n ga ta ne a r l ys t a g e b yt h e1 a t e d e v e l o p m e n to fc u r l y1 e a fs i g n i f i c a n t l yw a ss m a l l e r a tt h e s a m eti m e ，l e a fa n g l eb e c a m el a r g e r i th a san o d ed u r i n gf l o w e r d e v e l o p m e n tt h e r e ， a n d b e n d i n g s i l i q u ea l s oc h a n g e d t h e p e r s p e c t i v e 2 )s t u d i e dt h er e s p o n s eo ft h eh o r m o n e i nm u t a n t r e s p e c t i v e l y ， m u t a n ta n dw i l dt y p eg r o w na tt h ed i f f e r e n t c o n c e n t r a ti o no fh o r m o n e w ef o u n dt h a tm u t a n t sw e r e m o r e s e n s i t i v ei nh i g hc o n c e n t r a t i o n so fi a at r e a t m e n to nt h e i n h i b i t i o no fi a at h a nt h ew i l dt y p e 3 )a n a l y s i so fm u t a n t sont h eg e n e t i c ： t h em u t a n t s w a sh y b r i d i z e dw i t ht h ew il d t y p e ，s e l f h y b r i d i z e d f 1 p o p u l a t i o n sw e r et h ew i1 d t y p et r a i t s c h a r a c t e r sa p p e a r e d is o l a t e di nf 2 t h ep l a n ts e p a r a ti o nr a ti oo fw i1 d t y p ea n d m u t a n tt r a i t sw a s3 ：1i nf 2p o p u l a ti o n s i ts h o w e dt h a tt h e m u t a t i o nw a sas i n 9 1 er e c e s s i v eg e n em u t a t i o n 4 ) b yu s eo fm a p b a s e dc l o n i n gt e c h n 0 1 0 9 y ， m u t a n tg e n e h a sb e e ni n i t i a l l y1 0 c a t e di nt h et h i r da r a b i d o p s i sc h r o m o s o m e s ， w i t hm 0 1 e c u l a rm a r k e r sc l o s e l vli n k e dg a p a b k e yw o r d ：a r a b i d o p s ist h a l i a n a- c 口，m u t a n t sl e a fc u r l i a a m a p b a s e dc l o n i n g s s l p u i 缩写词 a b a a f l p b p b s a d n a e d t a e t b r ( e b ) k b i 从 n c b i n p a p c r s a m s s l p s d s 英文全称 英文缩写词表 a b s c i s i ca c i d a 皿p l i f i e d f r a g m e n t1 e n g t h 中译名 脱落酸 p 0 1y m o r p h is m 扩增片段长度多态性 b a s ep a i r碱基对 b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s分群分析 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 e t h y l e n ed i 锄l n et e t r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸钠 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 k il o _ b a s ep a i r千碱基对 3 1 n d 0 1 y 1a c e t i ca c i d日9 i 哚乙酸 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a ti o n 美国生物技术信息中心 舻卜n a p h 2 t h y l p h t h a l 锄i ca c i d 生长素极性运输抑制剂 p 0 1 y m e r a s ec h a i nr e a c ti o n聚合酶链式反应 s h o o ta p i c a lm e r i s t e m茎顶端分生组织 s i m p l es e q u e n c el e n g t hp 0 1 y m o r p h i s m s 简单序列长度多态性 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：巧艮确 印年厂月嘲 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“ 作者签名：袁移萄 日期： 即年r 月_ 日 别醛各断 日耋：下川夕日 一个拟南芥叶卷曲突变体性状遗传分析及基冈定位 l j - 月l j 吾 植物的叶器官是植物体的基本营养器官，是植物体进行光合作用 的主要场所，对植物的生命活动起着重要的作用。绝大多数单叶由叶 基( 1 e a f b a s e ) 、叶柄( p e t i 0 1 eo rr a c h i s ) 和叶片( b l a d eo rl a m i n a ) 三部分构成。植物为了适应自然环境，植物叶在漫长的进化过程中发 展成今天这样的千姿百态。不同物种叶的大小、颜色、形状差别非常 大，即使是在同一植物中，叶发育的不同阶段形状也可以完全不同。 叶的发育是植物形态建成的一个重要方面，与植物株型的形 成密切相关，叶发育的调控机理十分复杂。早期叶片发育可被人为的 分为三个阶段：叶原基的起始，背腹性的建立和叶片的延展。一般 认为，植物在胚胎时期已经建立起体轴( b o d ya x is ) 并且通过顶端 ( s h o o t a p i c a l ) 和根端( r o o t a p i c a l ) 中干细胞( s t e m c e l l ) 的 繁殖增生使之在其后的发育过程中得到延续。叶是具有三维构造的极 性结构，其形态发育受多方面的影响，参与叶极性建成( p 0 1 a r i t y f o 姗a t i o n ) 的属性( i d e n t i t y ) 基因或者作用于激素信号途径的基 因的突变，都会导致叶最终形态的异常乜。3 1 。叶卷曲属于叶不正常发育 的一种。近几年来，随着对大量影响叶形态建成的突变体的研究，人 们对叶片发育的机制有了比较深入的了解，发现叶片发育受到体内严 格的遗传机制和体外环境因子的调控。 1 1叶原基的发育 硕”1 学化论文 叶和花属丁植物的侧7 器官。侧牛器官的原基是在攀的顶端分 卜组织( s h o o t a p l c a lm e r ls t e m ，s a m ) 巾形成的h 。在s a m 的中央 有一| j 缓慢分裂的细胞组成s a m 的中心区。这些细胞始终处于非分 化的状态，具有持续分裂能力，足植物生长发育的干细胞。在s a m 中 心区的外吲，细胞分裂的速度u 月显加快，这些快速分裂的细胞，组 成了s 州的周边区。在周边区里，宵些成簇的细胞性质丌始发生变 化，这j 。细胞称之为“基细胞”( f 0 u n d e rc e l l ) 。基细胞形成时，从 表而观察，细胞的形状并不发生明显变化，但足原位杂交实验显示这 些细胞巾的某些基因的表达已经发牛了改变。基细胞的分裂速度非常 快，侧生器官的原基就是通过基细胞的分裂形成的( 图卜1 ) d a _ _ 【，! 囤卜1 顶端分主组织的构造图。叶厚基形成于边缘区域，睬基以小的半球型产生并且发育 戍水平的叶片。在叶原基中可以区分出背面与腹面，( ) 侧观图，( r ) 顶观图 j 前，拟南芥、卡米和金鱼草的分子遗传学研究发现在叶原基 的形成过程巾受剑众多丛圳的调控。在单子叶植物堆水r h 彤、口7 7 仞， 这个基因参与s a m 的维持“，这个过 i t 牵涉到麒娩幽龠肼曰结合域的 勰强乜a s y 狲e t r l cl e a v e s li 如1 ) ? r 。u g hs h e a l h 2 r s 2 ) ? 删例s 翻伽删 的相瓦抑制“1 。在双子叶植物中，筋口仃仞，的 2 一个拟南芥叶卷曲突变体性状遗传分析及基大1 定位 同源基因具有相似的功能。拟南芥中在s a m 中表达的廊础基因有4 个：删刀、删豫删阿和s 耐1 3 。如果这些基因持续表达，s a m 的 特征将会一直保持下去，但是在随后的叶原基发育和叶片发育过程 中，删基因在s a m 中一直处于沉默状态，因为它们受到了a r p 蛋 白以及它们的辅助因子蛋白，即l a t e r a l0 r g a nb o u n d a r i e s ( l o b ) 一 类的a s l 蛋白的抑制。 尸舻形蚴叨，( 用m ) 和尸聊仞( 用功基因控制叶边界的形成，但 它们并不是s a m 形成和维持所必需的基因，利用吲哚类生长素处理叶 原基局部的顶端分生组织时，生长素的运输受到p i n l 和p i d 的调节， 从而引起叶的分界( l e a fd e l i m i t a t i o n ) 1 4 。1 引。拟南芥p 勘j 突变体的 表型是整个花序呈针状。p 勘，是由于生长素极性传导过程中的外运载 体p i n 失去活性所造成的n5 1 。在p 咖j 花原基的分生组织侧面点施工从， 该处能够长出一个新的花原基：在分生组织中心点施i a a ，花原基会 以此为中心形成一个环状分界n 6 1 利。肋在子叶原基的边界表达， 它的转录受外源生长素诱导影响。p j 跌变体子叶表型与p 勘- 相似， 但与p 咖- 不同的是，p j d 子叶融合的情形较少，突变体大多表现子 叶数目增加或减少，从而破坏子叶的对称发育。p 而助j 口双突变体子 叶完全消失，但s a m 的功能正常，能够形成叶原基，然而这些叶原 基却表现叶序异常，而且多彼此融合n 引。这两个基因的功能研究表 明，用加和肋作用冗余，它们不仅控制叶的边界形成，而且调控子 叶的生长发育。 最近的研究发现，生长素和a r p k n o x 蛋白在叶发育中的作用途径 硕士学位论文 是相互联系的。在器官特化早期，用加和觑脚基因在s a m 中表达的 区域几乎互为补充n 钔。此外，生长素信号或p i n l 活性受觑锄基因家 族的舻( 晟襁矿，磁刀耽m 凶基因表达的负调控，说明彻侧基因的表 达调节生长素的极性运输n 卿阳：亦有研究表明，生长素的积累会抑 制删基因，如删丁膨孺西2 r 砒叵好( 研彻基因乜，因而推测，l ( n o x 蛋白和生长素通过相互作用建立了一个反馈环，两者之间的平衡关 系影响了叶分生组织的分界。近来研究发现，删基因的表达直接受 至0 p c g ( p o l y c o m bg r o u p ) 家族蛋白c u r l y l e a f ( c l f ) 和s w i n g e r ( s w n ) 的 抑制，而这两个蛋白具有组蛋白转甲基酶活性，说明胁珊的表达调 控也存在表观遗传因素乜引。 1 2 叶极性的建立 在双子叶模式植物拟南芥中，叶的极性建立是叶发育中的核心 问题。叶极性建立大体可以分为两个阶段。第一阶段，是极性建立的 决定阶段。这个阶段从基细胞形成到叶原基出现。在这一阶段，组成 原基的细胞团所有细胞几乎都处于同等的状态，它们具有很强的分裂 能力，但不出现细胞的分化。实际上，决定细胞如何分化的程序此时已 经启动。第二阶段，是极性分化阶段。这个阶段，叶细胞不断分化，最 终形成在体轴上不对称的叶器官。在叶的发育中形成三个轴向的极性 分化：近远轴、基顶轴、和中侧轴( 图卜2 ) 。三个体轴的极性建立 过程是相互关联的，其中近一远轴的建立是最基本的乜3 i 。近轴面与远轴 面的表皮细胞形态截然不同，近轴面的细胞是不平整的均一大小的细 胞，而远轴面的细胞则是相对扁平的拚图式的细胞，近轴面由于有高 个 m * 卷帅宪变仆代帆遗传 折堆什 效的光合作用，有丰富的口1 绿素，而远轴而的时绿索较少。牛h 对于近 轴面远轴丽有丰富的气孔，进行人量的气体变换在组织水平卜，近 轴面分化f b 栅栏组织，远轴而分化 h 海绵组织。在维管束中也表现出 极性分化，近轴面分化成木质部，远轴面分化成韧皮部。近远轴极性 分化的机制广泛存在于各个侧生组织中。 a d a i i a i d i s l a l o r o x i m a i 刚卜z 片分化的二二个轴札分圳为基顶轴、近远车、左矗轴 叶的近一远轴建立受到众多基出的调控，会伟草突变体口6 a 旋第 一个与腹背轴分化有关的突变体“，p 船口突变体一巾较早出现的口1 ( 着生位置较低的叶) 在叶片们近轴而经常有一些成簇的带有远轴而 特征的细胞。在后期发生的一些叶巾，叶细胞特征完企远轴而化，结果 形成一些针状叶，无基一顶轴和中一侧轴的分化。删基因已经克隆， 基冈产物是一个m y b 蛋白。5 。村脚是一个很大的基凶家旗，儿中有一 些馏成员已经证明足转录i 日子，因此排测，删可能也足一个转录 因子。拟南芥中删的同源基冈是爿j ，舭，肼1 上倒陋5 1f 爿， 但是没有f b 现背腹性消失现象1 “。后来的研究表明，爿卯确实与删 硕十学位论文 有相似的功能，只是拟南芥的另一个基因麟吼硎f ，删在彳卯的调控 途径中也起作用。只有当彳卯和脚同时突变后，才出现背腹性缺失 的表型，双突变植物也会形成针状叶。拟南芥中的另一个突变体a 妇 表型与a s ，非常相似乜钉，遗传学分析表明彳韶基因可能与彳卯调控 同一叶发育途径。彳影基因也已经克隆了，该基因产物含有一亮氨酸 拉链结构，可能参与蛋白间的相互作用。 在叶近一远轴极性建立研究中，拟南芥中发现了另一类在促进近 轴面分化过程中起重要作用的基因：忍凇比例f ，伟矽，删脱蜊 f ，朋桫，和腰脱删f ，腰矽。这三个基因互为同源基因，编码一个 同源异型结构域一亮氨酸拉链蛋白( h o m e o d o m a i n l e u c i n ez i p p e r ， 简称h d z i p 蛋白) ，都在叶原基的近轴面表达。肋和剧矿的突 变体脚y 一- 研口肋6 j 均为半显性突变体，具有很多卷曲的叶片，而 且这些叶的外层都具有近轴面的性质，如大量的表皮毛等乜引。虽然 抬y 的隐性突变体未观察到极性丧失的表型，但它的显性突变体 舶y 叫则表现出近轴化的侧生器官，同时肋6 肋矿朋矿隐i 生三突变体 只能发育成一个具远轴化特征的针状子叶和下胚轴，无任何两侧对称 结构口们。研究说明这三个基因都参与了叶近轴面极性分化的调控。 现在的研究结果表明h d z i p i i i 家族的因子受到m i c r o r n a l 6 5 以 及脂类信号的调控，而彳5 啪& 可以正调控h d z i p i i i 家族的因子的活 性。在拟南芥的研究中发现控制远轴面的因子主要有蜊嬲j ，f ，删家 族中的脚彪、拗船、肌 3 1 和觑删刃f ，觑彻家族中倒阳、尼彻、 脚，尼蝴肺丁以正调控拗励肭活性，同时尼删叮可以抑制只留的 一个拟南芥叶卷曲突变体件状遗传分析及堆因定位 活性，而册调控近轴面的过程可以抑制删船j ，和删朋历的表达活 性。虽然遗传学实验已经找到了一些调节叶极性建立的关键基因，在 很大程度上丰富了人们对叶发育过程的认识，但是仍有一些问题需要 更深入的研究来解决。例如：这些与叶极性建立有关的重要基因，它们 之间的关系是怎样的? 目前发现的这些重要基因几乎都是转录因子， 它们是如何调节下游基因的? 下游基因是哪些? 近一远轴的建立是怎 样影响基一项轴和中一侧轴的建立? 目前在叶形态决定方面存在不同的观点。新细胞决定理论( n e o c e l lt h e o r y ) 认为细胞的形态和行为之间的相互影响最终决定了叶 的形态口2 1 ( 图卜3 ) 。一些转基因试验证实，细胞的状态发生变化后， 通常伴随着叶片形态的改变口3 l 。 g 一一蒌g 一一三篓竺嚣= = 骂萼m $ 呻 、o 啦i 黼s d 侧l 硪岫i i o n 暑， 图卜3 叶形态建成的新细胞理论模型 1 3 叶卷曲发生的可能分子机制 叶是从顶端分生组织( s a m ) 发育而来的。顶端分生组织是由一团 未分化但不断分裂着的细胞组成的，这些细胞的分裂速度从中心区向 周边区减慢，伴随着发育的进程，周边区某一部分奠基细胞被决定形 成叶原基，当叶原基开始产生极性分化并从细胞分裂转入细胞生长阶 7 硕士学位论文 段时，呈抱合状态的未展开叶才随着细胞的生长而逐渐平展。那么， 控制这一发育进程的一系列基因的突变，以及影响细胞分裂、生长及 分化的因素都有可能造成叶的发育异常，包括叶卷曲的发生。主要在 三个层次上控制植物的生长发育：胞内( i n t r a c e l l u l a r ) 控制、胞间 ( i n t e r c e l l u l a r ) 控制和胞外( e x t r a c e l l u l a r ) 控制。胞内控制大多在 基因水平进行，基因通过编码各种蛋白来控制细胞的生理生化活动； 胞间控制的主角是植物激素，起着协调不同组织和细胞间生理活动的 作用；而胞外控制是外在环境因子对植物生长发育的影响。这三种控 制水平的作用不是相互独立的，几乎所有的情况下都是相互交叉、相 互影响的，因此植物在生长发育过程中出现的各种现象及调控是这三 种水平的控制因子相互协调和相互作用的结果。 1 3 1 基因调控 t s u k a y a 的新细胞决定理论( n e oc e l lt h e o r y ) 认为细胞的状态 和行为之间的相互影响最终决定了叶的形态晒2 j ，叶卷曲的发生可以认 为是某些直接或间接地影响细胞分裂、生长或分化状态的基因产生突 变所致。如果叶片中部的细胞分裂和生长的速度比边缘的快，则发育 成正高斯曲率下卷的叶片，反之叶片向上卷曲或边缘褶皱，呈负高斯 感电鼍怒喜攀。qc ? 端疑与一令t c p ( ：i e o s i n t eb r n c h e d l c y c l o i d l a p c f ) 转录因子，金鱼草c j 力突变体叶片边缘褶皱，要引入切口才能使叶片 平展。拟南芥的庙棚突变体具有与金鱼草c j 硖变体相似的叶片边缘 褶皱的形态。在力旷d 突变体中一些御基因的转录水平降低，是由 于过量表达的m i r j a w 基因与御基因结合使其降解所致。因此，由 一个拟南芥叶卷曲突变体性状遗传分析及幕冈定位 m i r n a 介导的对御基因的表达调控决定了细胞分裂的时空抑制，进 而在叶的平展发育中起到作用口5 | 。拟南芥伽已j ，删，仇基因是果 蝇助加砌鲫印仇一基因的同源基因，该基因能抑制花的同源 异型基因彳翻删艿在叶中的表达。c 硖变体具有正常的根、下胚轴 和子叶，而它的茎和真叶都变小了，同时检测到叶片中细胞数目的减 少和细胞伸长的降低，说明晓硅因可能通过参与叶细胞的分裂和伸 长来控制叶的平展发育口6 j 。 当叶原基发生，叶的特征己决定时，原基就开始了朝三个方向 的极性分化，正确的极性分化是形成平展、宽阔的叶片的必要条件。 在许多发生叶卷曲的突变体中都能观察到部分或完全的近远轴极性。 丧失。例如，j c 以突变体在近轴面产生了一些远轴面特征的细胞7 1 ； 莲花状叶的a 妇突变体在近轴面也出现远轴面化的表皮细胞盼刨；叶片 上卷的胎舌叶肉细胞近远轴极性混乱口引；虽然叶偏下性生长的圳- 表 皮细胞极性没有改变，但它的叶肉细胞的近远轴极性发生了紊乱，尤 其是在叶片发生卷曲的部分h o i ；玉米的门以旬显性突变体的近远轴 极性发生了倒转，即近轴面表皮远轴面化，远轴面表皮近轴面化h 。 越来越多的实验证明m ic r o r n a ( m ir n a ) 在植物器官极性分化上 具有重要的调控作用。叶的近轴面决定基因家族h d z i pi i i 成员是 m i r l 6 5 1 6 6 的靶基因，在它们的s t a r t 区域都有个共同位点能被 m i r l 6 5 1 6 6 识别和剪切。在拟南芥叶上卷突变体蜘- 中，维管系统简 化，叶肉中的背腹极性丧失，m i r l 6 5 累积降低而导致近轴面决定基因 肛瞰上调并且其表达扩散至叶的远轴区域，而远轴面决定基因肌 颈七学能论文 被下调，说哽魁瑾因通过介导臻主怼矗栗调节挺沪z 羔p 王薹王基因煞表达， 从而维持叶的平展发育“叫。 1 。3 2 激素调控 叶的发生和发育与植物激素的作用密切相关。植物激素作为种 化学信号，介导着细胞与细胞之间、器官与器官之间、环境与植物之 间的相互作用，这种相互作用贯穿在整个植物生长发育的全过程中。 许多生长素突变体如啪岔黑n 群都表现出叶片上卷的特征。同时利 用d r 5 ：g u s 和c y e b l ：g u s 的表达，在酋s 厶a 突变体的第一片叶中分 别检测生长素的分布和细胞的分裂情况，表明叶尖端生长素起始的不 对称性使得内源生长素不对称分布，并最终导致缁麓的不对称分裂和 分化，从而产生鲻臻】露鲤叶不对称发育的现象秘帮鑫此外外源的生长 素可以使叶片组织产生偏土性生长。铡如，将斓草的叶片切戒l 。s 毫 米的条带置于外源撇或薹姒下，2 0 小时后可以使该条带偏上性生长大 予3 0 0 度“引。生长素、细胞分裂素、乙烯和油菜素内嚣鹭对植物细胞的 分裂、伸长生长和分化都有着或多或少的作用。虽然圆前对激素在叶 发育中的作用研究得还比较欠缺，但激素在维持叶平展发育中的作用 仍是不可忽视的。 1 3 3 环境影晌 光、温度和重力等因素对植物的生长发育状态都会产生显著的 影响。叶的形状与它所处的位篝有密切的关系，而且也会受到外界的 条件的影响。当植物的生长受到一定的限制时，如：矿质元素或营养 物质缺乏以及较低的光通量等都会导致叶结构简诧并减小。光的波长 l o 一个拟南芥叶卷曲突变体性状遗传分析及基冈定位 对叶的发育也有显著影响。在远红光下发育的叶片比在白光下发育的 叶片往往更小、更细、更长，而且缺刻明显减少。拟南芥a s 和a 妇 突变体具有相似的叶片表型，它们的第一对真叶常产生莲花状叶 ( 1 0 t u s 一1 e a f ) 的现象。高盐、低温及渗透压等环境都会使突变体的生 长受到抑制，但并不影响莲花状叶产生的频率，而在高温条件及 觑比硎基因突变的1 e r 背景下能使莲花状叶产生的频率增高n 利。这也 从另一方面证明了环境对叶卷曲发生的影响。 1 4 图位克隆 1 4 1 图位克隆的原理 图位克隆( m a p _ b a s e dc l o n i n g ) 又称定位克隆( p o s i t i o n a l c l o n i n g ) ，1 9 8 6 年首先由剑桥大学的a 1 a nc o u l s o n 提出，是正向遗传 分析的理论基础。其基本原理是根据功能基因组在基因组中有相对 较稳定的基因座，利用分离群体的遗传连锁分析，通过构建高密度 的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，将未知的基 因定位于物理位置己知的分子标记附近，最终确定未知基因在基因 组d n a 上的很小的已知区间中，分析该区间中所有基因，找出可能 的基因并进行克隆和鉴定。 迄今为止，用定位克隆技术克隆到的植物基因已有几百个。其 中大部分来自于拟南芥、水稻和番茄，也有少部分来自于大麦、小 麦、甜菜、马铃薯和胡椒。由此可以看出，在定位克隆已得到的植 物基因中，主要来自拟南芥、番茄和水稻等模式植物。它们由于具 有较小的基因组，高密度的分子标记连锁图和较稳定成熟的转化系 硕+ 学位论文 统等原因，成为定位克隆技术的主要应用对象。 1 4 2 图位克隆的技术路线 随着拟南芥c 0 1 u m b i a ( c o 卜o ) 基因组全序列的测序完成( t h e a r a b i d o p s i sg e n o m ei n i t i a t i v e ，2 0 0 0 ) ，c e r e o n 公司几万个遗传 多态标记的公布( h t t p ：w w w a r a b i d o p s i s o r g c e r e o n ) ，及d n a 多态检测技术的进步，分子作图已经得到极大的加强，大大地缩短 了图位克隆的时间。拟南芥的图位克隆主要在已测序的c o 卜o 和l e r 两种生态型中进行，主要过程如( 图卜3 ) 。 图卜3 拟南芥中图位克隆技术路线示意图m 3 左边是典型的图位克隆所需一年时间的流徉图， 随着植株的生长突变体的表型可以检测出米： 以边是在c o 卜。背景下一个位于第五条染色体隐性 突变的图位克隆实例的关键步骤中拟南芥的五对染色体。 1 ) 将突变体植株和另外一个生态型( c o 卜o 或者l 盯) 的植株杂交， 构建图位克隆群体。在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作 为父本还是母本是没有关系的。2 ) 播种f l 代种子。在f 1 代植物的 生长过程中，对其表现型和基因型进行分析，该突变基因是隐性突 1 2 变还足陀突变，敲好通过刈b 标l l 的分祈求确认r l 代1 = l l f 物址杂 介体，l 町且征杂交过挫一lr 我没自j 巳锵以。”1 然也彳必鼗确、虬i 术 的牛态租7 景。3 ) 突变基雎i 的柑定位( f ih lp a s sm a p p i n g j 。r 1 代植物门交得到f 2 代种子，大约播种6 0 0 个个体，约有1 5 0 个个体 被认为是纯合体。然后从这1 5 0 个个体的叶子或者其它组织小制箭 d n a 用于基冈型分析。4 ) 突变基圳的精细定位。5 ) 搭定突变基冈。 143 拟南芥中常用的分子标记 拟南井中最常川的分子标址柏简单序列长度多念阽【鼯p ) 、 酶切扩增多态序列( c a p s ) 、限制酶切扩增长度多态4 陀( f l ，r ) 、币 核什酸多态性( s i ，s ) 和捩得忡酶切扩增多态j r 列( d c a p s ) 。它们凡 n 两个同f f 勺特女l 。：1 ) 它们部足兆砬性，这意l 睐着既可以对植物染包 体的塾田型进彳j = 研究，也可以从h 传兜隆的群作- 1 - 收集到比大缱的 信，包。2 ) 它竹j 都是以p c r 为韭础的，能够通过毋1 脂耕凝胶球进行分 析，埸r 操作且成小较低。s s i 。p 枷i 记足利川舸乖复序列的n f 变性 对引物j l j 丁扩增含1 短重复序列的片段，这个重复序列的i 毛皮在 曲r 1 1 q 卷型t i ，不| 亓| 。冈此，从c o l 和l 。e r 的d m 巾扩增剑的p c rj 托 物也是4 ：同的，这个大小芹异可以通过凝胶b 泳观察剑”j 。虫罔卜1 f 144 鉴定分子标记和突变位点之间连锁的方法 b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ( b s a ) 是鉴别分子标记和突变位点 之间的连锁的有效方法“，这种方法是检测d n ap o o l ，而不是检测单 个的样本，这样在箍定连锁时就减少了p c r 反应的数量。图卜5 就是 运用b s a 方法鉴定突变基因与分子标记连锁的例子。突变体是在l e r 生态型的背景下诱发的，与c o l 生态型杂交后产生了图位克隆群体。 准备两种d n a 样本，样本a 是从产生f 2 代图位克隆群体的f l 代植株的叶 片中提取的d n a ；样本b 是1 0 0 株突变株d n a 的混合池即d n ap 0 0 1 。样本 a 在所有遗传座位上都是杂合的，作为对照。样本b 在突变的位点上是 纯合的l e r ，而且在突变点附近大部分都是l e r ，但与不连锁的标记处 是杂合的。选用覆盖整个基因组2 2 个s s l p 的分子标记米检测这两个样 本。 口d w d * 4n t ， v孵 削卜5 突变毖冈与分子标记连锁的b s a 分析 个拟南芥叶卷曲突变体件状遗传分析及基刚定位 每张图中左边泳道是杂合体对照即样本a ，右边是突变体的d n a p o o l 样本。l e r 特有的条带用木标出。从电泳图中可以看出，在大部分 位点处杂合体对照与f 2 突变体之间c o l 和l e r 扩增产物的比例基本上 是相同的，这表明突变基因和这些位点都是不连锁的：而在c i w l 和 n g a 2 8 0 两个标记处，很明显f 2 突变体只有l e r 特异的条带，从而可以 判断出这个在l e r 中产生的突变基因是和c i w l 和n g a 2 8 0 两个位点相连 锁的，根据这两个分子标记在染色体中的位置可以知道，这个突变基 因应该是位于拟南芥第一条染色体的短臂上。 s s l p 分子标记常被用来优化l e r c o l 群体的b s a 分析。它们 大部分是专门针对图位克隆设计出来的。关于这些引物的序列、p c r 条件以及在l e r 和c 0 1 中的片段大小等详细信息都能够从网上获得。引 物的序列在拟南芥信息资源( t a i r ) 网站上已公布。因为同样的p c r 程 序可以用来扩增所有的分子标记，而且同一块胶可以分离它们的产 物，所以完全可能在几个小时以内就能完成一次b s a 分析。 1 5 本文的研究目的及意义 植物叶发育研究在最近几年来取得了重大的进展，许多叶发育 相关的关键基因、小分子i m 和生长素等调控因子被研究揭示出来。 它们之间复杂的相互作用也得到了初步分析和阐述。根据这些结果， 已经初步明确了叶发育的分子调控网络，但是它们之间更清晰的作 用网络仍不十分明了。 通过突变体分析是研究叶形态发生机制的最好策略，突变体分 析是剖析复杂生物学过程的强有力工具，拟南芥和其它一些植物突变 硕+ 学位论文 体己被广泛用于植物发育和代谢途径的研究。利用激素突变体来研究 激素代谢及其分子机制己有不少成功的例子，如生长素和脱落酸等突 变体。突变体分析不仅可以使人们对某一复杂生物学过程提出合理的 假设，而且可以使我们更精确地找出研究生理和发育问题的新方法。 在利用t d n a 插入诱发突变过程中，获得一个叶形态发育异常的 突变体，与目前发现的叶卷曲突变体的表型不一样，主要表现为早期 叶在横向和纵向都出现不同程度的卷曲，而且叶的边缘没有皱褶或缺 刻现象，叶张角变大。本论文以正向遗传学的方法对该突变体- c 口进 行了细胞形态学、激素敏感性分析和遗传分析，通过遗传杂交分析证 明该突变体是由于单基因隐性突变所致。同时，由于拟南芥c o 卜o 和 l e r 两种生态型已被全部测序，并且已建立大量的分子标记，图位克 隆技术近年来在拟南芥研究中被广泛应用，其技术路线已经非常成 熟，因此，本论文利用图位克隆技术，选用s s l p 分子标记设计引物对 突变基因进行了初步定位。最终目的是要确定并解析突变的基因，以 探究该突变基因与叶形态发育的关系，为进一步阐明叶发育的分子调 控网络提供实验证据。 一个拟南芥叶卷曲突变体悱状遗传分析及皋【大j 定位 2 1 实验材料与试剂 2 1 1 植物材料 材料与方法 野生型拟南芥( 彳，a 6 j 却s j s 拍a - j a 力a ) ：生态型c o l u m b i a ( c 0 1 ) ， 生态型l a n s b e r ge r e c t a ( l e r ) ， 突变体j c 以 2 1 2 培养基 植物培养基：m s 培养基( m s 培养液+ 1 5 蔗糖+ l 琼脂糖，p h 5 8 ) 表2 1 植物培养基成分表 成分 ( 髓g 1 )母液 大n l l 4 n o ， l6 5 0 1 6 5 9 量 ik n 嘎1 9 0 0i o x 1 9 0 9 兀 k h 2 p o 1 7 0 ( g ) 1 7 0 9 索 m g s 0 | 。7 h 2 0 3 7 0 3 7 0 9 l i c a c l z 2h 2 0 4 4 0i o x 4 4 9 k i o 8 3 4 1 5 m g h ，b o 6 2 3 l o m g 微 m n s 0 4 h 2 0 2 2 3 5 0 x l l l 5 m g 量l z n s o | 7 o 3 。6( m g ) 4 3 0 m g 兀 n a 2 m o o 2 h 2 0 0 。2 5 1 2 5 m g 豢 c u s 瓴5 h 2 0 o 0 2 5 1 2 5 m g c o c l ：6 h 2 0 0 0 2 5 1 2 5 m g 铁 n a 2 一e 盯r a 3 7 32 0 x 7 4 6 m g 盐 f e s q i 7 h 2 0 2 7 8 ( m 由 5 5 6 m g 有甘氮酸 2 o i o o m g 机盐酸吡咯醇v b l o 55 0 x 2 5 m g 兀v盐酸硫氨紊v b 60 4 2 0 m g 索肌醇 1 0 0( m g ) 5 0 0 9 烟酸 0 5 2 5 m g 1 7 硕十学位论文 按表中配方配制母液，一种物质全溶后再加另一种，以防产生 沉淀，最后用蒸馏水定容至1 l ，于4 保存。 制备o 5 m s 培养基( 1 l ) ：分别按比例量取大量元素母液、铁盐 母液、微量元素母液和有机元素母液，加适量激素和各种附加物， 全溶后定容至1 l ，调p h 至5 8 ，高压灭菌2 0 分钟。 2 1 3 酶类与试剂 r t a qd n a 聚合酶( a m b i o g e n 公司) 苯酚鼎国公司 氯仿鼎国公司 d n t p鼎国公司 引物的设计用生物软件p r i m e rp r e m i e r5 o ，而合成是由上海生 工公司完成。 2 1 4 激素类 i 从( o 0 1m 0 1 l ) ：取o 1 6 91 a a 先溶于少量7 0 乙醇中，用d d h 2 0 定容至1 0 0 m l ，过滤灭菌，4 避光保存。 a b a ( 2 0 0ug i i l l ) ：称取2 0m ga b a ，溶于少量酒精，以无离子水 定容至1 0 0 m l ，过滤灭菌，4 避光保存。 2 1 5 常用溶液 t r i s h c l( 1 m 0 1 l ) p h8 o 1 l t r i s 一碱1 2 1 1 9 浓h c i 4 2i n l d d h ：o定容至1 l o 5 me d t a组份浓度o 5me d t a ( p h 8 o )配常0 量1 l 配置方法 称取1 8 6 1 9n a ：e d t a 2 h ：0 ，置于1 l 烧杯中。 加入约8 0 0 m l 的去离子水，充分搅拌。 一个拟南芥n f ，卷曲突变体性状