（有机化学专业论文）sdf1α衍生多肽库及不对称姜黄素衍生物的设计、合成及生物活性研究.pdf

中文摘要 题目：s d f 1 a 衍生多肽库及不对称姜黄素衍生物的设计、合成及生 物活性研究 专业：有机化学 姓名：邵伟艳 导师：古练权教授 摘要 本论文主要在固相有机合成的基础上进行了两方面的工作：第一部分，通过 固相多肽合成( s p p s ) 方法构建了基质细胞衍生因子s d f - l a 衍生肽库s d f l i b 一4 7 ， 研究了它们与s d f l a 的天然受体c x c r 4 的相互作用；第二部分，利用固相反应 策略建立了不对称姜黄素衍生物的合成路线，并成功获得一系列具有新型结构的 不对称姜黄素衍生物，测试了它们对硫氧还蛋白还原酶的抑制活性。 1 趋化因子s d f 1 a 衍生肽库的合成及其与受体c x c r 4 的相互作用研究。 趋化因子受体c x c r 4 与其天然特异性配体s d f 1 a 组成性地表达于多种细胞 组织中，形成了c x c r 4 s d f 1 a 作用轴，具有多种生理功能。近年研究发现， c x c r 4 还参与了诸如恶性肿瘤的转移和h i v - 1 感染t _ 细胞等多种重要的病理过 程。c x c r 4 作为一个新的靶点，其抑制剂的研究具有重要的意义。实验表明， 用s d f 1 a 直接作为药物可有效抑制c x c r 4 + 癌细胞的迁移，如乳腺癌的肺转移； 同样也可有效抑制h i v - 1 感染t - 细胞。但s d f 1 c t 直接作为药物将干扰体内天然 趋化因子s d f 1 a 的生理功能，引起机体功能紊乱，而且易产生炎症反应等多种 副作用。本工作以s d f 1 u 为先导分子，对其序列进行删节重组，合成衍生小肽， 通过研究它与c x c r 4 的相互作用，发现了部分衍生肽具有较高的受体结合作用， 并能引起受体内化，但不具有激活受体信号传导功能，具有深入开发研究c x c r 4 抑制剂的价值。主要研究结果如下： 1 1 设计并合成了含有4 7 个多肽分子的肽库s d f l i b 4 7 。合成工作采用组合化学 的茶袋法策略，用f m o c t b u 固相多肽合成方法完成。多肽产物通过 m a l d i t o fm s 分析证明。 2 1 通过多肽分子抑制单抗1 2 g 5 与受体c x c r 4 的结合实验，筛选出与受体 中文摘要 c x c r 4 有较高结合活性的4 个多肽分子( s n 3 4 、s n 3 9 、s n 4 6 、s n 4 7 ) ， 成为进一步研究的优选肽序。 3 ) 对优选肽序( s n 3 4 、s n 4 6 、s n - 4 7 ) 进行进一步的序列重组及生物素标记， 结合固相分段合成法得到了含有1 3 个多肽分子的小肽库。通过e s i m s 和 h p l c 进行了分离和鉴定。 4 ) 采用细胞i e l i s a 法研究了小肽库中生物素标记的多肽分子与c x c r 4 + m o l t - 4 细胞的结合作用，发现其中的s n 3 4 、4 7 ，4 7 11 等有较强的细胞结 和能力。 5 ) 用流式细胞分析法证明了多肽( s n 3 4 、4 7 ) 与细胞的结合是作用于细胞表面 的受体c x c r 4 ，并可引起c x c r 4 的内化。 6 1 采用t r a n s w e l l 实验方法研究多肽趋化细胞运动的能力及抑制s d f 1 a 引起的 细胞趋化运动的能力。实验证明s n - 3 4 ，4 7 没有明显的细胞趋化能力，即不 具有信号激活功能。 7 ) 各种测试实验结果表明，s n 3 4 ，s n 4 7 具有较强的受体亲和活性，并能引起 受体内化而不具有激活受体信号传导的功能，说明它们具有抑制c x c r 4 的能 力，从而在阻断h w - i 感染及抑制肿瘤转移等方面具有潜在的应用价值，值 得进一步研究。 2 不对称姜黄素衍生物的固相合成及其对硫氧还蛋白还原酶的抑制活性研究 姜黄素衍生物是一类具有广泛生理活性的小分子化合物，其大量的类似物被 合成并进行构效分析及药物筛选。由于传统有机合成方法的局限，衍生物的结构 基本都是对称的，即分子两侧具有相同的取代芳香环结构；而分子两侧的芳香环 不同的不对称衍生物较少研究报道。本部分工作采用固相有机合成方法，利用固 相载体的伪稀释效应成功建立了不对称的姜黄素衍生物的合成方法，并研究了所 得系列新型不对称姜黄素衍生物对硫氧还蛋白还原酶的抑制活性。 1 ) 以c l t r 树脂作为固相反应的载体，结合姜黄素的液相反应条件完成了b 二 酮类和单酮类不对称姜黄素衍生物的固相合成。该合成方法充分利用了固相 载体的伪稀释效应造成的区域选择性，得到了不对称的化合物；操作简便， 产物具有较高的纯度可直接进行活性筛选，因此可以应用于组合化学，在构 建相应化合物库进行高通量活性筛选等方面，具有较好的优越性。 i i 中文摘要 2 ) 在合成1 3 - 二酮类姜黄素衍生物的过程中，发现分解硼姜黄素衍生物的络合物 只需要h 2 0 的存在，无需酸催化。 3 ) 对硫氧还蛋白还原酶的抑制试验结果显示，部分不对称姜黄素衍生物有较强 的酶抑制活性，其中一侧芳香环为五元呋喃环的不对称姜黄素衍生物有很强 的抑制活性，具有深入研究的价值。 关键词：s d f 1 a 衍生肽，c x c r 4 抑制剂，内化，不对称姜黄素衍生物，硫氧还 蛋白还原酶抑制剂 i a b s t r a c t t i t l e ：d e s i g n ，s y n t h e s i sa n db i o l o g i c a le v a l m i o no fs d f - l e t d e r i v e d p e p t i d e sa n du n s y m m e t r i c a lc u r c u m i n d e r i v a t i v e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：w e i - y a ns h a o s u p e r v i s o r ：p r o f l i a n - q u a ng u a b s t r a c t t h i sw o r ki sf o c u s e do nt w oa s p e c t s ，t h e1 “i sd e s i g n ，s y n t h e s i sa n db i o l o g i c a l e v a l u a t i o no fs d f - l a - d e r i v e dp e p t i d e st a r g e t i n gc x c r 4 ；a n dt h e2 “4p a r ti sf a c i l e s y n t h e s i so fu n s y m m e t r i c a lc u r c u m i nd e r i v a t i v e sa n di 担i l t h i b n o 哪a c t i v i t yt ot r x r a ut h ec o m p o u n d sw e r es y n t h e s i z e db a s e do ns o l i d p h a s eo r g a n i cs y n t h e s i ss t r a t e g y 1 d e s i g n ，s y n t h e s i s a n db i o l o g i c a le v a l u a t i o no fs d f l u d e r i v e d p e p t i d e s t a r g e t i n gc x c r 4 c x cc h e m o k i n er e c e p t o r4a n di t sl i g a n ds d f - l e t a r es p e c i a lf u n c t i o n a la x i st h a t p l a y si m p o r t a n tr o l ei nc e l lp h y s i o l o g y f u r t h e r m o r e ，c x c r 4i s i n v o l v e di nv a r i o u s d i s e a s e s , s u c ha sm e t a s t a s i so f s o m ec a n c e rc e i l sa n dt h ef u s i o no f h t v - 1w i t ht c e l l s n o w a d a y s ，c x c r 4i st a r g e t e di nm o r ea n dm o r er e l a t i v en e wd r u g sd e v e l o p m e n t a s n a t u r a ll i g a n do fc x c r 4 ，s d f l aw a sp r o v e nh e l p f u lw h e nu s e da sh i v - ii n v a s i o n i n h i b i t o r s a l t h o u g hw i t l ll o t so fs i d er e a c t i o n s i nt h i sw o r k , ap e p t i d el i b r a r yd e r i v e d f r o ms d f l aw a sd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，a n dt h e i rb i o l o g i c a la c t i v i t i e st a r g e t i n g c x c r 4w e r ei n v e t i s g a t e d ar e c o m b i n a n ts m a l lp e p t i d e sl i b r a r yd e r i v e df r o ms d f - l e tw a sd e s i g n e da n d s y n t h e s i z e db yf m o cs o l i dp h a s ep e p t i d es t r a t e g y a l lp r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e d b ym a l d i t o fm s 2 1t h eb i n d i n ga c t i v i t yo fp e p t i d e st oc x c r 4 + c e l l sw a ss t u d i e db y1 2 g 5 c o m p e t i t i v eb i n d i n gt e s t f o u rp e p t i d e ss n - 3 4 ，s n 一3 9 ，s n 一4 6 ，s n - 4 7w e r es h o w n s t r o n gb i n d i n ga b i l i 够t oc x c r 4 + c e l l s 3 ) f u r t h e rm o d i f i c a t i o nb a s e do ns n 一3 4a n ds n 一4 7w e r ep e r f o r m e da n dr e l a t i v e p e p t i d el i b r a r y , i n c l u d i n gb i o t i n - l a b e l e dp e p t i d e s ，w a so b t a i n e da n dc h a r a c t e r i z e d 4 1c e l l b a s e de n z y m e l i n k e ri m m u n o s o r b e n ta s s a ys h o w e dt h a ts n 一3 4 ，s n - 4 7 ， v a b s t r a c t s n - 4 7 11h a dh i 曲b i n d i n ga b i l i t y 、v i t hm 0 卫4c e l l ，w h i l es e q u e n c er f f e s h c a n n o tb i n dt oc x c r 4 十c e l l s 5 、p e p t i d e ss n - 3 4a n d4 7 w e r ep r o v e nt ob i n dt oc x c r 4a n di n d u c ei t s i n t e r n a l i z a t i o nb yf l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i sw i mt h ea s s i s to ff r r c a v i d i na n d p e 一1 2 g 5 6 、t h ec h e m o t a x i ca s s a yi n d i c a t e dt h a ts n 一3 4a n ds n - 4 7w e r en o tt h ea g o n i s to f c x c r 4 7 、s n 一3 4a n ds n - 4 7h a v et h ep o t e n t i a lf o rf u r t h e rs t u d ya sa n t a g o m s to fc x c r 4 b a s e do na b o v ew o r k s 2 f a c i l es y n t h e s i so fu n s y m m e t r i c a lc u r c u m i nd e r i v a t i v e sa n d i n v e s t i g a t i o no f t h e i rt r x ri n h i b i t o r ya b i l i t y c u r e u m i nh a sb e e nr e p o r t e dt op o s s e s sav a r i e t yo f b i o l o g i c a la n dp h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t y an u m b e ro fc u r e u m i n d e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e da n d i n v e r s t i g a t e d h o w e v e r , s t u d i e so nu n s y m m e t r i c a lc o m p o u n d ss t i l lr e m a i ns c a r c eo w i n gt ot h e s y n t h e t i c a lb l o c k s i nt h ew o r k ，w ed e v e l o p e daf a c i l es o l i d - p h a s es y n t h e t i cr o u t et o u n s y m m e t r i c a lc u r c u m i nd e r i v a t i v e sa n di n v e s t i g a t e dt h et r x ri n h i b i t o r ya b i l i t yo f o b t a i n e ds u b s l a a t e s 1 ) b a s e do nt h ep s e u d o d i l u t i o ne f f e c to fs o l i ds u p p o r t s ，1 3 - d i k e t oa n dm o n o k e t o u n s y m m e t r i c a lc u r c u m i nd e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e d o nc l t rr e s i n t h e d e v e l o p e dr o u t ec o u l db ee a s i l ya p p l i e dt oc o m b i n a t i o n i a lc h e m i s t r yt oc o n s t r u c t c o m p o u n dl i b r a r y sf o rh i g ht h r o u g h p u ts c r c e m n go fd r u g 2 ) i tw a sp r o v e nt h a tt h ed e c o m p o s a t i o no fb o r o n - c u r c u m i nd e r i v a t i v e sc o m p l e x e s o n l yd e p e n d e do ni - 1 2 0 ，a n dh c lw a sn o tr e q u i r e d 3 ) p a r to fc o m p o u n d sw e r ei n v e s t i g a t e dt h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft r x r , w h i c hi sa n i m p o r t a n te n z y m ei n v o l v e di nc a n c e rb i o l o g y c o m p o u n dl d ，3 a ，3 c ，3 d ，3 e ，w h i c h h a v ef u r a ng r o u po no n es i d eo fs t u r c t u r e ，s h o w e dp o t e n t i n h i b i t o r ya c t i v i t y f u r t h e rs t u d i e sa r ei np r o c e s s k e yw o r d s ：s d f l u - d e r i v e dp e p t i d e ，c x c r 4 ，i n t e r n a l i z a t i o n ，u n s y m m e t r i c a l c u r c u m i nd e r i v a t i v e s ，t r x ri n h i b i t o r s v i 中山大学博士学位论文 邵伟艳 第1 章前言 本学位论文工作主要分为两部分：第一部分是天然多肽s d f 1 旺衍生多肽库 的设计合成及其与受体c x c r 4 的作用研究；第二部分是不对称姜黄素衍生物的设 计合成及其对硫氧还蛋白还原酶的抑制作用研究。本章在对这两部分工作所涉及 到的背景及研究进展等方面进行系统综述的基础上，提出本课题的研究内容及研 究意义。 1 1 趋化因子与受体概述 趋化因子是一类小分子量的、结构相关的、具有趋化作用的细胞因子，可与 七次跨膜g 蛋白偶联受体相互作用而诱导多种白细胞的定向迁移。此外，趋化因 子在体内还涉及广泛的生理和病理作用。 1 1 1 趋化因子与受体的定义与分类 趋化因子( e h e m o k i n e s ，c h e m o a t t r a c t a n tc y t o k i n e s ，c k ) 是指能使细胞发生趋 化运动( 细胞向高浓度刺激物方向的定向运动) 的一类细胞因子【1 一i ，由7 0 1 0 0 个氨基酸残基组成( 约8 - 1 0k d a ) ，至今已发现5 0 多种，属于一个小分子的分泌 蛋白超家族。根据靠近氨基端的半胱氨酸残基的数目和排列方式，可将趋化因子 分成四个亚家族：c x c 4 苣, 亦称为洳趋化因子。分子中有4 个半胱氨酸残基，近氨 基端的2 个中间间隔1 个其他氨基酸( x ) ；c e 耄又称b 趋化因子，分子中也有4 图1 - 1 趋化因子普遍存在的三维构象 f i g 1 - 1g e n e r a ls t r u c t u r eo f c h e m o k i n e s 中山大学博士学位论文邵伟艳 个半胱氨酸残基，近氨基端的2 个是邻近的，中间不间隔其他氨基酸；睽，又称y 趋化因子，分子中仅有2 个半胱氨酸残基，近氨基端只有1 个；a 口c 苑又称6 趋 化因子，分子中有4 个半胱氨酸残基，近氨基端的2 个中间间隔3 个其他氨基酸。 大部分趋化因子的一级结构具有较高同源性 3 1 ，如c x c 与c c 成员之间有 2 0 一3 0 的同源；x r a y 和n m r 技术分析这类分子的晶体结构和溶液中的构象， 结果证明大部分趋化因子的三维结构类似( 图1 1 ) ，有以下共同点： 1 c k s 分子量小，在8 - 1 2 k d 之间： 2 、蛋白质一级序列具有较高同源性，c x c 与c c 成员之间：2 0 3 0 ； 3 、多数c k s 含有4 个保守的c y s ，1 和3 位c y s 、2 和4 位c y s 形成功能 分子必需的两对二硫键； 4 、c k s 有2 个螺旋，3 个p 折叠二级结构域； 5 、不同c k s 具有相似的空间结构。 趋化因子受体( c h e m o k i n er e c e p t o r s ，c k r ) 1 2 ，卅属于鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 ( g 蛋白) 偶联7 次跨膜受体超家族( g p c r s ，g - p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s ) ，通常 表达于免疫细胞、内皮细胞等细胞膜上。分子i = = i = 1 3 3 0 个氨基酸组成，7 个跨膜区将 分子分成细胞外自由的n - 端、3 个细胞外环、跨膜区、3 个细胞内环、胞内c 端几 个部分 图1 - 2 趋化因子受体的基本结构 f i g 1 - 2s 仃u c t t t r eo f c h e m o k i n er e c e p t o r s 趋化因子受体迄今已鉴定出2 7 种，根据其所结合的配体不同分为四个亚家族 c x c 类受体( c x c r ) 、c c 类受体( c c r ) 、c 类受体( c r ) 和c x 3 c 类受体( c x 3 c r ) 所有趋化因子受体都属于膜蛋白，其与配体结合后通过细胞内的g 蛋白传递 2 中山大学博士学位论文 邵伟艳 相应信号。其结构也有共同特点： 1 序列中含有7 个跨膜区域，c 端位于胞内，有s e r t h r 位点，参与信号转 导； 2 不同c k r 之间具有同源性； 3 胞内区与g 蛋白偶联，g 蛋白由g b a 组成，a 亚单位具有g t p 结合位点和 g t p 酶活性； 4 c k r 未与c k 结合时，g b a 呈聚合状态，a 与g d p 结合；当与c k 结合后， a 与g t p 结合，g b 游离，活化下游效应物 5 与c k r 偶联的g 蛋白有多种，与趋化运动有关的g 蛋白a 亚单位多为百 e t 咳敏感的g i 。 c h e m o k i n e i l g a n d t r er e p o r t o rg e n e 图1 - 3 趋化因子与受体键合引起的多重信号传导 f i g 1 - 3s i g n a lp a t h w a y sb yt h ei n t e r a c t i o no f c h e m o k i n er e c e p t o ra n dc h e m o k i n e 1 1 2 趋化因子配体受体功能轴及其涉及的生理和病理作用 趋化因子在体内参与的多种生理反应都是通过与其特异性受体发生相互作 用，激籼n - - j g n t n 信号传导而引起的1 5 - 1 0 1 ( 图1 3 ) 。研究显示，这种信 号传导过程是多重的：趋化因子先与受体特异结合，引起受体偶联g 蛋白，g 蛋 3 中山大学博士学位论文邵伟艳 白的亚基激活磷脂酶c ( p l c ) ，促使磷脂酰肌醇4 ，5 二磷酸( p i p 2 ) 分解产生第二 信使1 , 4 ，5 - 三磷酸肌醇( i p 3 ) 和1 ，2 一二酰基甘油( d i a c y l g l y c e r o l ，d a g ) ，导致细 胞内钙离子释放，并激活蛋白激酶c ( p r o t e i n k i n a s ec ，p k c ) 和其他蛋白酶。蛋 白激酶c 引起的各种蛋白的磷酸化进一步产生一系列下游事件，如活化其它多种 蛋白酶、调节相关基因表达和改变细胞形态及引发生理反应，其中最典型的反应 即引起细胞趋化。这些趋化因子引起的信号传导能被百日咳毒素抑制，提示趋化 因子受体偶联的是抑制性g 蛋白( g i ) 。趋化因子受体的激活涉及多种细胞内信 号传导途径，而这些种类众多的不同信号传导途径依赖于不同的细胞类型、受体 和配体。尽管如此，受体，配体的键合作用、钙离子的浓度变化及趋化细胞产生定 向运动的功能是整个信号传导过程的三个主要特征，可以作为体外评价和筛选趋 化因子功能激动剂或抑制剂的参考。 趋化因子的生理作用主要是从循环系统中募集白细胞，到达损伤与炎症部 位，促使伤口的愈合与清除病原体。趋化因子对白细胞的特异性决定于该细胞 表面相应受体的表达。随着研究的深入，人们发现趋化因子与其受体相互作用还 具有其它重要的、广泛的生理作用 1 1 , 1 2 , 1 3 】，包括免疫调节、抗病毒感染、调节造 血与血管生成、参与细胞生长及代谢等。临床上面临的诸多疾病 1 4 , 1 5 , 1 6 】，感染性 疾病如病毒及细菌感染，变态反应性疾病如哮喘和皮炎、其他炎症如类风湿关节 炎、骨关节炎、痛风、过敏性肺炎、肺纤维化、多发性硬化、肾小球肾炎、移植 排斥反应、结节病、动脉粥样硬化、牛皮癣、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、恶 性肿瘤的生长与转移等从疾病机理上都涉及到一种或几种趋化因子与受体的相 互作用。因此近年来，以趋化因子及其受体为作用靶点，通过激活或拮抗趋化因 子受体的信号传导来控制趋化因子系统的功能可望用于控制和治疗相关疾病。 1 2s d f - l a 及其受体c x c r 4 基质细胞趋化因子s d f 1 【1 7 19 】( s t r o m a lc e l l - d e r i v e df a c t o r1 ) 或称前b 细胞 刺激因子( p r e - bc e l ls t i m u l a t o r yf a c t o r , p b s f ) ，属于c x c 类趋化因子，系统命 名为c x c l l 2 ，是已知唯一能与受体c x c r 4 结合并激活其下游信号传导的天然 趋化因子。大量研究表明s d f 1 a 与其受体c x c r 4 组成性地、广泛地表达于多种 细胞和组织中，二者形成了特殊的配体一受体生物学轴( s d f 1 a c x c r 4b i o l o g i c a l a x i s ) ，参与了体内很多重要的生理和病理过程，成为近年的研究热点。 4 中山大学博士学位论文邵伟艳 1 2 1s d f 1 a 与受体c x c r 4 的合成与分泌 s d f - i 主要在骨髓基质细胞表达，另外在骨髓、血管内皮细胞和平滑肌细胞 及c d 3 4 + 、c d 3 8 + 造血祖细胞中亦有表达。其它c x c 类趋化因子的基因定位于 染色体4 号，而s d f 1 在人体定位于1 0 号染色体长臂，并且在人和鼠种间s d f 1 有高度保守性，仅有一个氨基酸残基发生突变。s d f 1 有两个亚基，s d f 1 a 和 s d f 一1 p 口0 1 。s d f 1 b 在羧基端比s d f 1 c t 多出4 个氨基酸残基，但二者结构和功能 都很类似。本工作以s d f l a 为研究对象。 s d f 1 a ： 16 1 1 1 62 12 63 l3 6 k p v s l s y r c pc r f f es i w a ra n v k hl k i l nt p n c al q i v a 4 1 4 6 5 l5 6 6 l6 6 r l k n nn r q v ci d p k lk w i q ey l e k al n 图1 4s d f 1 a 的氨基酸序列组成 f i g 1 - 4t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f s d f - l a c x c r 4 1 2 1 1 是s d f 1 a 的天然特异性受体，是一个高度保守的g 蛋白偶联的7 次 跨膜蛋白，通过两种途径被发现。首先用i l 8 r 基因探针从人血单核细胞基因库中 分离提纯出一个新的e d n a ，编码3 5 2 个氨基酸，命名为孤儿受体l e s t r ( 白细胞 表达的7 次跨膜受体) 。后来利用功f 1 c d n a 的方法，在亲t 细胞h i v - 1 感染的c d 4 + t - 细胞中分离出一个含有h i v - 1 辅助受体的e d n a 质粒，其中最长的o r f 编码3 5 2 个氨基酸残基，序列与l e s t r 相同，因为它是h i v 的融合辅助因子，又称之为融 合素( f u s i n ) 。c x c r 4 在多种细胞包括造血细胞中都有表达，并且在血管内皮细 胞、神经元、神经胶质细胞和星形胶质细胞中有很高的表达量。 1 02 03 04 05 06 0 m e g i sr y t s dn y t e em g s g dy d s m ke p c f rf e n a nf n k i fi p t i ys i i f i 下g i v gn g i v t 7 08 0 9 0 1 0 01 l o1 2 0 l v m g yq k k l rs m t d ky r l h l s v a d ll f v i tl p f w av d a v an w y f gn f l c ka v h v iy t v n l 1 3 01 4 01 5 01 6 01 7 01 8 0 y s s v li l a f is l d r yl a ha t n s qr p r k ll a e k vv y v g vw i p a ll l t i pd f i f an v s e a 1 9 02 0 02 1 02 2 02 3 02 4 0 d d r y ! c d r f yp n d l wv v v f qf q h i mv g l i lp g l v ll s c y ci i i s kl s h s kg h q k rk a l k t 2 5 02 6 02 7 02 8 02 9 03 0 0 t v i l il a f f ac w l p yy i g i si d s f i l l e i ik q g c ef e n t vh k w i si t e a la f f h cc l n p i 3 1 03 2 03 3 03 4 03 5 0 l y a f lg a k f kt s a o h a l t s vs r g s sl k 。sk g k r gg h s s vs t e s e s s s f hs s 图1 - 5c x c r 4 的一级序列 f i g 1 - 5t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f c x c r 4 5 中山大学博士学位论文 邵伟艳 1 9 9 6 年首次证实孤儿受体l e s t r 的配体就是s d f 1 a ( c x c l l 2 ) ，所以命名 为c x c r 4 。同年也证实c x c r 4 就是t 细胞向性的h i v - 1 的辅助受体。s d f l a 与 c x c r 4 的高度亲和力和绝对特异性相互作用构成了一个与细胞间信号传递、细胞 迁移有密切关系的偶联分子对，在生物体内发挥重要作用。 1 2 2c x c r 4 及s d f 1 a c x c r 4 功能轴的生理功能及参与的病理过程 研究显示s d f 1 a c x c r 4 生物学轴参与了白细胞浸润、细胞迁移和器官发育 等一系列重要的生理过程。有证据【2 2 1 表明s d f l a 或c x c r 4 基因敲除后的小鼠 有半数胎死腹中，即使出生也均在一小时内死亡，表现为造血障碍、血管形成异 常、心肌隔膜缺陷和b 淋巴细胞减少、小脑神经元分布异常等，说明它们对免疫 系统、循环系统、中枢神经系统的发育都异常重要。在正常的生物体内， s d f l c t c x c r 4 生物学轴2 4 2 5 1 的正常的生理功能不能被轻易破坏以免造成功能紊 乱。 除了正常的生理功能外，s d f 1 a 和c x c r 4 类似其它的趋化因子与受体，也 参与了很多的病理过程，其中引起重大关注的主要有以下两方面： 1 ) s d f - i a 与受体c x c r 4 的相互作用参与了肿瘤转移 近年来，除了正常的生理功能外，人们发现趋化因子在肿瘤中也发挥多种作 用2 6 , 2 7 0 8 一，包括控制白细胞浸润至肿瘤、调节肿瘤相关的血管生成、激活宿主 对肿瘤的特异性免疫应答、以自分泌或旁分泌方式刺激肿瘤细胞增殖、控制肿瘤 细胞运动等。特别是近来不少研究发现趋化因子s d f 1 a 与受体c x c r 4 的相互作 用在恶性肿瘤转移中发挥了很重要的作用【3 0 ，3 1 ，3 2 1 ，成为研究的热点。 恶性肿瘤是目前严重威胁人类生命健康的一种恶性病，其表现为肿瘤细胞失 去控制的异常增殖，这种异常增殖除了原发灶肿瘤的持续生长之外，还出现肿瘤 向邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管和体腔转移到身体其他部位，即发生肿 瘤扩散，而这往往是恶性肿瘤致死的主要原因。因此抑制肿瘤转移是有效控制肿 瘤生长，降低死亡率的重要手段。 肿瘤转移是一个具有高度组织性，非随机性和具有器官选择性的多步骤过 程。近期研究发现肿瘤细胞的转移机制也采用了与趋化白细胞运动相似的趋化因 子介导机制【3 3 1 。许多肿瘤【3 4 , 3 5 州，如乳腺癌、非小细胞肺癌( n s c l c ) 、前列腺 癌、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌和结肠癌等细胞表面高表达独特的，非 6 中山大学博士学位论文 邪伟艳 随机性的有功能活性的趋化因子受体c x c r 4 。而肿瘤细胞易发生转移的器官含 有高浓度的，与肿瘤细胞趋化因子受体相关的配体s d f 1 a ( 图1 6 ) 。当这些肿瘤 细胞通过血液或淋巴循环接近靶器官时，配体s d f 1 e t 与肿瘤细胞表面受体 c x c r 4 特异性结合，激活下游信号传导，引发癌细胞的肌动蛋白( v l a 4 ，l f a l ) 聚合形成伪足，并促使癌细胞分泌金属蛋白酶( m m p 9 ) 降解细胞外基质 3 7 , 3 8 。 这些反应导致肿瘤细胞黏附到内皮组织，并穿过靶器官表面细胞间隙，进而穿过 基底膜，沿着配体的浓度梯度深入靶器官，经过进一步地浸润、细胞增殖形成继 发癌细胞巢，引起癌症病情急速恶化，成为不治之症。 图1 - 6s d f 1 与c x c r 4 的相互作用介导细胞的迁移机制 f i g 1 6s d f i c x c r 4a x i si n v o l v e di nc e l lm i g r a t i o n 以上肿瘤细胞的转移机制显示，抑制s d f 1 a c x c r 4 配体受体的相互作用 可有效抑制肿瘤向某些特定器官转移。研究证明【3 “，用c x c r 4 单抗抑制s d f 1 a c x c r 4 的相互作用，可抑制6 0 一8 0 的人乳腺癌细胞在裸鼠的肺移植。c x c r 4 的小分子肽类拮抗剂t 2 2 t 1 4 0 t 2 4 0 9 】可抑制乳腺癌细胞、横纹肌肉瘤对s d f l i t 的 趋化反应。c x c r 4 的高效特异性抑制剂a m d 3 1 0 0 4 0 1 也可抑制s d f l c t 对卵巢癌 细胞的效应。因此，抑制肿瘤细胞表面的趋化因子受体与其配体的相互作用，特 别是研究趋化因子受体抑制剂，在不干扰体内天然s d f 1 e t 正常的生理功能情况 下( 完全阻断s d f 1 的活性是危险的，因为s d f 1 基因敲除的小鼠出现b 淋巴 细胞与骨髓细胞的生成缺陷) ，干预治疗肿瘤转移是切实可行的，也正在成为一 个研究热点。 2 ) c x c r 4 是h i v 1 感染t 细胞的辅助受体 趋化因子受体c x c r 4 于1 9 9 6 年被证实是h i v - 1 感染宿主细胞的主要辅助受 体之一，又称协同受体( c o r e c e p t o r ) 4 1 , 2 1 】。病毒感染起始于h i v - 1 与宿主细胞 7 中山大学博士学位论文邵伟艳 膜受体c d 4 的相互作用。h i v - 1 病毒的包膜糖蛋白复合物g p l 2 0 - g p 4 1 中的g p l 2 0 首先与c d 4 结合，导致g p l 2 0 构象改变，继而与靶细胞膜上的辅助受体c x c r 4 或c c r 5 结合( 通常病毒感染后期以c x c r 4 为主) ， 促使g p 4 1 构象改变， 暴 露出其疏水的n 末端肽序列( 融合肽) 并插入宿主细胞膜，从而促使病毒囊膜与 靶细胞的细胞膜融合 4 2 , 4 3 , 4 4 ( 图i 一7 ) 。病毒将遗传物质注入宿主细胞，并在靶细 胞内完成逆转录、整合及复制增殖过程，破坏宿主的免疫系统，诱发获得性免疫 缺陷综合症( a i d s ) 。因此从最初阻断病毒与细胞的融合将是一种阻断病毒感染 的有效途径，即开发病毒入侵抑制剂。 图1 - 7h i v - i 入侵宿主细胞的主要过程及各种抑制剂的靶点 f i g ，l - 7 t h ef u s i np r o c e s so f h i v - 1w i t ht a r g e t e dc e l l 影响病毒入侵过程中的关键步骤可以有效干预病毒入侵：抑制病毒g p l 2 0 与c d 4 的键合：抑制病毒g p l 2 0 利用辅助受体c x c r 4 或c c r 5 ：阻断 病毒g l m l 引发的膜融合过程。基于上述位点的各种抑制剂已有不少所道，但目 前只有膜融合抑制剂t 2 0 删( 3 6 m e rp e p t i d e ) 已成功上市，其余都在研发中。阻 断c x c r 4 与g p l 2 0 键合的抑制剡如a m d 3 1 0 0 1 柏j 5 】等也表现出了很好的药用前 景，说明开发c x c r 4 的抑制剂，阻止其与g p l 2 0 的结合，可作为研究治疗h i v - 1 感染的有效途径之。 实验证明【4 6 蚓，s d f - 1 旺作为c x c r 4 唯一的天然配体，其与受体的高特异性 结合可以有效保护t 细胞免遭h i m - 1 的感染。其抗感染的机制目前认为来自两方 面：一方面，s d f 一10 l 与c x c r 4 的高特异性结合产生立体位阻阻断c x c r 4 与 h i v - 1g p l 2 0 结合：另一方面，s d f 1 a 与c x c r 4 的高特异性结合引起大量受体 迅速地发生内化，即大大降低了细胞表面受体的数量，因而降低了h i v - 1 的感染 几率保护了t 细胞。但直接用s d f l e t 作为药物使用可能产生炎症反应，并且影 r 中山大学博士学位论文邵伟艳 响体内天然的s d f 1 e t 发挥正常的生理功能，造成功能紊乱。因此对s d f 1 c t 进 行序列重组，删剪得到短肽衍生物，保留与受体c x c r 4 的结合作用，或引起受 体内化，都可有效阻断c x c r 4 g p l 2 0 的键合，抑制h i v - 1 的感染。 1 2 3 以受体c x c r 4 为靶点的药物研究现状 从以上可以看出，受体c x c r 4 参与了很重要的生理和病理过程，特别是其 在肿瘤转移和h i v - 1 的感染中所起到的作用，使它成为重要的药物靶点。研究它 的抑制剂，可进行两方面的药理筛选：一方面，抑制剂能否有效阻断天然配体 s d f l a 与c x c r 4 的相互作用，干预治疗与这组作用轴相关的病理过程，特别是 抑制恶性肿瘤的转移；另一方面，抑制剂能否有效阻断g p l 2 0 与受体的键合，或 通过引起受体内化，发挥抑制h i v - 1 感染的作用。 受体c x c r 4 属于g 蛋白偶联受体，在人类基因组中大约有6 0 0 个基因编码 这个家族的蛋白，是最大的一组药物靶点。在传统的小分子药物的发现过程中， g 蛋白偶联受体也是目前最成功的一类蛋白质药靶，在已经或正在成为药物开发 对象的大约5 0 0 个靶分子中，g 蛋白偶联受体约占o 4 5 ，其次是酶，约占o 2 8 ； 激素、因子约占o 1 1 ；离子通道占0 0 5 ；核内手体占0 0 2 ；d n a 占o 0 2 ；还有 0 0 7 未知。这些统计数据表明以趋化因子受体c x c r 4 作为药物靶点在理论和 实际应用中都是切实可行的【4 8 1 。 综合目前趋化因子受体c x c r 4 的抑制剂的研究策略，主要有以下几类： 1 ) 中和抗体【4 9 】 中和抗体是指可中和细胞因子功能的功能性抗体，是细胞因子研究中常用的 抑制剂，通过制备多种针对趋化因